TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6在糖尿病性白內障中的表達及意義

羅云娜，趙海霞，張伊暉

（1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院近視眼激光治療中心；3.內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 眼科）

隨著我國人口老齡化的嚴重以及2型糖尿病發(fā)病的增多，糖尿病性白內障的比例越來越高，發(fā)病機制主要是血糖濃度升高導致晶狀體內滲透壓升高，從而導致纖維吸水腫脹、變性而渾濁[1～3]。越來越多的研究表明晶狀體上皮細胞（lens epithelial cells，LECs）的過度凋亡和損傷可能會導致糖尿病性白內障的發(fā)生，而這個過程由于LECs中細胞因子含量的改變有關[4～7]。本研究主要通過測定2型糖尿病患者術前房水和LECs中TGF-β、IGF-1、bFGF和IL-6的含量，進而分析TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6在糖尿病伴隨白內障發(fā)病過程以及視網(wǎng)膜病變中的作用及臨床意義。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象及分組

隨機選取2017-10～2018-10來我院確診并接受超聲乳化白內障摘除聯(lián)合人工晶狀體植入術的80例患者，其中對照組為單純年齡相關性白內障患者24例，平均年齡72±13歲，白內障病史為6±3a；實驗組為糖尿病性白內障組，根據(jù)有無視網(wǎng)膜病變分為無糖尿病視網(wǎng)膜病變組（non-diabetic retinopathy，NDR）和伴有非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變組（（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR），其中NDR組患者36例，平均年齡69±11歲，糖尿病病史為15±7a，白內障病史為7±4a，NPDR組患者20例，平均年齡70±12歲，糖尿病病史為13±6a，白內障病史為6±4a。

1.2 試劑和儀器

利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定房水中 TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量，試劑盒購于Adlitteram diagnosticlaboratorie公司（法國）；利用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-PCR）檢測LECs中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的mRNA表達，逆轉錄和qPCR試劑盒購于Promega公司（美國）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集（1）房水收集。術前麻醉患者后打開眼瞼，用1mL一次性無菌注射器接0.45mm針頭，在角膜上方邊緣1mm前房處刺穿，輕壓眼球吸取房水0.2mL，置1mL EP管中-20℃保存，用于后續(xù)相關指標檢測；（2）晶狀體上皮細胞的收集

患者在行常規(guī)超聲乳化白內障摘除聯(lián)合人工晶體植入術中時，截取白內障眼中央5～7mm的晶狀體前囊膜，即晶狀體上皮細胞，置于離心管中，-80℃保存，用于后續(xù)相關實驗。

1.3.2 ELISA TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量測定嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。將樣品用試劑盒中的稀釋液稀釋后置于酶標板孔中，加入抗體后用封板膠紙密封，37℃孵育1h。去上清，用洗滌液洗三次，加入HRP標記的二抗，37℃孵育30min。分別加入底物A和B，37℃避光孵育10min后加入終止液，酶標儀450nm處讀數(shù)，繪制標準曲線。

1.3.3 RT-PCR使用Trizol試劑從勻化的組織樣本中分離出總RNA。RNA濃度和質量測量對RNA進行定量。RevertAid?First Strand cDNA Synthesis kit（Promega，USA）進行TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6mRNA的反轉錄。qPCR利用iTaq?Universal SYBR-Green Supermix（Promega，USA）。TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的mRNA表達水平使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）標準化。

設置三個副孔，Cq值取平均值，mRNA的相對表達水平使用 2-ΔΔCq方法表示。

qPCR引物如下

TGF-β1 forward，5'-ACA CTC CAG CTG GGC TCT AGA GGG AAG CGC-3'

TGF-β1 reverse，5'-ACA CTC CAG CTG GGG TCC AGT TTT CCC AGG A-3'；

IGF-1 forward，5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'

IGF-1 reverse，5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'；

bFGF forward，5'-CAG CAG CTT GAC ACA CGG TA-3'

bFGF reverse，5'-AAA CAC CAA AGT GGC ATG TGA-3'；

IL-6 forward，5'-CTG AGA CGG GAC TCT GGC TA-3'

IL-6 reverse，5'-TAG CAC AAC AGT CGG GGA ATC-3'；

GAPDH forward，5'-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3'

GAPDH reverse，5'-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3'。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prim6對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)比較使用t檢驗，所有結果以均數(shù)±標準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組患者房水中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量比較

ELISA檢測不同組患者房水中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量，結果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，NDR組和NPDR組患者房水中TGF-β1、IGF-1和bFGF水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與NDR組相比，NPDR組患者房水中IGF-1水平進一步增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時，我們發(fā)現(xiàn)IL-6在三組患者房水中差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）。

表1 同組患者房水中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量比較Tab.1 Comparison of TGF-β1、IGF-1、bFGF and IL-6 contents in atrial water of patients in the same group

2.2 不同組患者LECs中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的mRNA水平比較

qPCR檢測不同組患者LECs中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的mRNA水平，結果與ELISA類似，結果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，NDR組和NPDR組患者LECs中TGF-β1、IGF-1和bFGF的表達顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖1～3）；與NDR組相比，NPDR組患者LECs中IGF-1的表達進一步增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖2）；同時，我們發(fā)現(xiàn)IL-6在三組LECs中的表達差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖4）。

3 討論

糖尿病是一種糖代謝紊亂的內分泌疾病，患者由于胰島素分泌相對不足，導致血糖異常升高，機體進而會發(fā)生各種組織、器官的病理性改變，引發(fā)多種系統(tǒng)、器官的并發(fā)癥[8～10]。白內障和視網(wǎng)膜病變是糖尿病在眼部引發(fā)的主要并發(fā)癥，也是臨床上最常見的致盲因素，這兩種癥狀一般同時發(fā)生[11]。糖尿病伴隨白內障患者的晶體結構遭到破壞而呈渾濁狀態(tài)，本研究在收集研究對象時，只選擇單純年齡相關性白內障或者糖尿病伴隨白內障患者，年齡控制在58～87歲，排除患其他眼科疾病的患者，這樣可以避免其他因素的干擾，從而確保研究背景的純凈和研究結果的可靠性。

目前的研究認為高糖導致的晶狀體內相關蛋白的異常糖基化是導致糖尿病伴隨白內障的重要原因，糖誘導的LECs的異常凋亡又是白內障發(fā)生的內在因素[12～14]。已有研究表明，高糖誘導能夠刺激LECs中bFGF和IGF-1表達的上調，從而導致晶狀體內代謝平衡的失調[15，16]。也有研究表明，白內障患者玻璃體中TGF-β1和IL-6的表達會異常增高，并且與眼底疾病病變程度呈正相關[17，18]。因此本研究主要探究單純單純年齡相關性白內障患者和糖尿病性白內障患者（NDR和NPDR）房水和LECs中TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的水平，探究糖尿病伴隨白內障發(fā)生的影響因素。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NDR組和NPDR組患者TGF-β1、IGF-1和bFGF的表達顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與NDR組相比，NPDR組患者IGF-1的表達進一步增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時，我們發(fā)現(xiàn)IL-6在三組的表達差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這說明TGF-β1、IGF-1和bFGF等因子可能是影響糖尿病伴隨白內障發(fā)生的重要因素，IGF-1可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變存在相關性。

本研究分析糖尿病性白內障患者與年齡相關白內障患者體內TGF-β1、IGF-1、bFGF和IL-6的含量變化，對于分析糖尿病發(fā)生以及視網(wǎng)膜病變、白內障發(fā)生的相關性具有重要作用，為糖尿病性白內障患者的治療和預后評估提供了參考依據(jù)。