青蒿琥酯對阿霉素致大鼠腎損傷的保護作用

陶 磊，李婷婷，馬旖旎，陳仁兵，李雪芹，王金娜

(山東省醫學科學院附屬醫院，山東第一醫科大學，濟南 250031)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床最常見的急危重癥之一，其發病率約為30%，并且與患者的預后不良有關，主要表現為突然喪失腎排泄功能，腎功能急性惡化[1]。全球每年約有400萬例死于AKI，且發病率和死亡率不斷攀升，造成嚴重的健康和經濟問題[2]。目前認為AKI是由于腎素血管緊張素系抑制劑和非甾體抗炎藥對腎進、出小動脈的收縮作用的干擾而導致的，而在加強利尿的情況下極易發生脫水，導致血流動力學改變，AKI情況進一步惡化[3]。臨床上對于AKI提倡早發現、早治療，研究報道，對AKI進行早期干預可以改善其預后，并降低腎功能進一步惡化的風險[4-5]。國內外對AKI的干預研究還處于探索階段[6]，因此，找到新的治療靶點顯得尤為重要。氧化應激被認為是細胞病理損傷的關鍵致病因素，其導致的病理損傷貫穿于多種腎病發生、發展的過程中。體內氧化物質增多、抗氧化物質減少加重了腎細胞內的炎癥反應，最終成為了腎病的發展及惡化的重要原因之一[7]。青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯(artesunate, ART) 是治療瘧疾的標準藥物, 而且還具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節及抗氧化應激的作用[8]。本研究中采用阿霉素(adriamycin，ADR) 誘導大鼠腎損傷，觀察青蒿琥酯對阿霉素腎病大鼠腎損傷的治療作用，并探討其可能的作用機制，為臨床治療提供合理用藥依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級雄性Wistar大鼠32只，體重220～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京) 2016-0006]。Wistar大鼠飼養于河北醫科大學第四醫院實驗動物中心[SYXK (冀) 2018-001]，屏障環境溫度18℃～24℃，濕度40%～60%，飼料、飲水均經過高壓滅菌處理。所有動物實驗通過河北醫科大學第四醫院實驗動物倫理審查(IACUC-4thHos Hebum- 201968)，并依據優化、減少、替代的 3R 原則進行實驗設計。

1.2 主要試劑與儀器

青蒿琥酯(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號: H32020967)；鹽酸阿霉素(美國Med Chem Express公司)；組織超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Maleicdialdehyde， MDA)以及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)測定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所；10%多聚甲醛溶液(北京索萊寶科技有限公司)。

全自動生化分析儀LX20PRO(美國Beckman Coulter公司)；Synergy HT 型多功能微孔板檢測儀(美國 Biotek公司)；防脫載玻片(北京索萊寶科技有限公司)；Tissue-Tek TEC 全自動組織石蠟包埋機(日本櫻花公司)；IVS-410 自動石蠟切片機(日本大和光機工業株式社)；CS-V1型攤片烤片機(孝感宏業醫用儀器有限公司)；303-4A數顯電熱保溫箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；BX41光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Qcapture圖像采集系統(加拿大QIMAGING公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 阿霉素腎病模型的制備及分組

全部大鼠適應性飼養1周后，隨機分為四組：空白對照組(NC組)、阿霉素模型組(ADR組)、青蒿琥酯低劑量組(ART-L)和ART高劑量組(ART-H)，每組8只。ADR 組、ART-L組和ART-H組均經大鼠尾靜脈注射阿霉素(7.5 mg/kg)[9]。造模第2天， ART-L組和ART-H分別給予25 mg/kg 和50 mg/kg的ART灌胃，連續灌胃3周，NC組給予等體積的生理鹽水。

1.3.2 一般情況

觀察內容包括各組大鼠的飲食、飲水、體重、毛色、大小便、水腫、精神狀況，以及死亡情況。

1.3.3 大鼠尿蛋白、血清生化指標的測定

分別于ART給藥1 周、2周、3周后，收集各組大鼠24 h 尿液，檢測尿總蛋白(UTP)；ART末次給藥24 h后，大鼠麻醉后，采用真空促凝采血管經腹主動脈采血3～5 mL，靜置后 3 000 r/min 離心 10 min，分離上層血清，全自動生化分析儀檢測血清中白蛋白(ALB)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)和腎功能指標血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的含量。

1.3.4 腎組織病理學分析

大鼠腎組織經4%多聚甲醛固定，經脫水、組織包埋后制成4 μm 厚石蠟切片，行HE染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。

1.3.5 腎組織 SOD、GSH-Px 活力、MDA含量的測定

取部分腎組織，使用預冷的生理鹽水漂洗后，加入 9倍體積的預冷生理鹽水，冰水浴中勻漿，4℃、2500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書分別檢測SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 一般情況

NC組大鼠無明顯異常表現，皮毛順滑，行動自如，眼、口、鼻無異常分泌物，尿便正常；阿霉素給藥后，大鼠出現精神萎靡，尿量不同程度下降，四肢水腫，體重減輕，毛欠光澤，禿頂，活動力差，進而出現紅色尿液、消瘦等癥狀；阿霉素給藥初期出現輕度腹瀉，1周后轉好；ART 組大鼠雖然也表現出體重下降，但毛色有光澤，活動力尚可整理表現要優于模型組，而ART-L組和ART-H組的大鼠體重相比無明顯差別，大鼠體重變化見圖 1。實驗全程期間各組大鼠均無死亡情況。

2.2 ART對大鼠 24 h 尿液中UTP含量的影響

ADR模型組大鼠各時間點24 h 尿總蛋白(UTP)含量均高于NC組。經ART干預后，大鼠尿液中UTP含量有一定水平改善。結果可見，ART-L組及ART-H組較ADR組UTP含量明顯降低，ART-H組較ART-L組進一步降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠體重變化Figure 1 Rat body weight changes in each group

表 1 各組大鼠不同時間點 24 h UTP比較

2.3 ART對大鼠腎功能指標的影響

表2分析結果可見，與NC組比較，ADR模型組大鼠血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)明顯升高。ART-L組和ART-H組兩指標較ADR組低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與NC組比較，ADR組大鼠血清白蛋白(ALB)降低，ART-H組和ART-L組較ADR組升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。而各組大鼠血清膽固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)。以上結果表明ART能改善ADR組大鼠的腎功能指標。

2.4 各組大鼠腎組織病理學變化比較

HE染色結果顯示(見圖2)，NC組大鼠腎小管排列緊密，腎小管上皮細胞無明顯病變；與NC組相比，ADR組大鼠腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，部分細胞崩解、細胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成； ART干預后，各病理癥狀明顯好轉，低劑量組大鼠可見部分腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，看見少量細胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，可見再生；高劑量組可見部分腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，刷毛緣脫落，可見明顯再生。以上病理結果表明ART能改善腎組織損傷程度，明確了ART對阿霉素致大鼠腎損傷的治療效果。

表2 各組大鼠生化指標檢測結果比較

2.4 ART對大鼠腎組織 SOD、GSH-Px活力、MDA水平的影響

由表3可見，與NC組比較，ADR組大鼠腎組織 SOD、GSH-Px活力降低，而MDA含量升高(均P<0.05);與ADR組比較，ART-L組和ART-H組大鼠腎組織SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量降低(均P<0.05)。

3 討論

ADR是一種常用的抗癌藥物。然而，其在正常組織，包括心臟和腎中的副作用限制了其臨床應用[10]。ADR引起的急性腎損傷模型是一個成熟的和高重復性的腎病模型。AKI以管狀細胞壞死為主要病理特征，所涉及的發病機制包括炎癥、氧化應激和凋亡等[11-12]，其中，氧化應激是由促氧化水平和對抗抗氧化防御機制之間的失衡導致的。研究表明ADR誘導的AKI與抗氧化狀態加劇有關，包括脂質過氧化最終產物丙二醛(MDA) 含量升高和腎組織中抗氧化酶水平降低，從而導致了腎代謝途徑的改變和腎血流動力學中斷[13]。ART是經FDA批準的應用于抗瘧疾治療的一線藥物，以往的研究表明，ART還具有很好的抗炎、抗腫瘤以及抗病毒等療效[14]，此外，ART能夠抑制抗氧化防御系統中非酶性和酶性成分活性，即GSH和SOD的水平降低，從而降低了細胞的氧化應激損傷[15-16]。對于ART能否通過降低了細胞的氧化應激損傷來改善ADR所致的腎損傷，需要進一步研究探討。

注: A：NC組；B：ADR組；C：ART-L組；D：ART-H組。圖2 大鼠腎的病理學改變Note. A, NC group. B, ADR group. C, ART-L group. D, ART-H group.Figure 2 Pathological changes of the kidney tissues in rats

表 3 各組大鼠腎組織 SOD、MDA和GSH-Px 水平比較

本研究利用ADR誘導的AKI大鼠模型探討ART對AKI大鼠腎損傷的保護作用及機制研究。研究結果顯示，與NC組相比，ADR組大鼠UTP及血清BUN、Scr水平升高，同時ADR組腎病粒結構嚴重損傷，腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，部分細胞崩解、細胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，符合急性腎損傷表現[11,17]。與ADR 組相比，ART-H組和ART-L組血清BUN、Scr水平明顯下降，受損的腎生理結構部分得到恢復，這表明ART能夠改善腎功能和腎組織的損傷。腎組織中 SOD、GSH-Px 活力和MDA水平可反映ADR處理后誘導的腎氧化和抗氧化狀態。本研究結果顯示模型組小鼠腎組織 GSH-Px 和 SOD 活力下降，MDA 水平升高，說明ADR可以造成腎組織的氧化和抗氧化狀態的改變，抗氧化酶水平下降，而脂質過氧化物水平升高。與ADR組相比，ART-H組和ART-L組的SOD和GSH-Px 活力都明顯升高，而MDA 水平明顯下降。結果提示，ART可以促進細胞內抗氧化物質含量增加，提高細胞抗氧化應激能力，從而保護細胞免受氧化應激的損傷，這與文獻中報道的一致[18]。

綜上所述，AKI能明顯改善ADR誘導的大鼠腎損傷, 其作用機制可能與AKI對細胞氧化應激的調節有關，而在此過程中涉及一些信號通路的激活，在以往的文獻中均有報道[19-21]，但還需要本研究進一步驗證。本實驗證實了AKI對ADR誘導的大鼠腎損傷的保護作用，從而為ADR腎損傷的臨床預防及治療提供了理論依據。