金花茶微觀結構鑒別及活性成分分析

程金生　李舒雅　萬維宏　曾雪琪

摘要：為開展金花茶微觀結構鑒別及活性成分分析，應用掃描電鏡獲得金花茶微觀結構信息，通過氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）分析金花茶的活性成分。研究表明，由電鏡可以觀察到金花茶葉子氣孔都分布在葉下表皮，每一片小區域都由中心氣孔從圓心向外延伸，像孔雀開屏狀，外緣角質膜呈細條紋狀。金花茶花朵的細胞則呈長圓形，棱角圓滑，排列聯系緊密呈網狀。花粉的形態一般呈長球形，少數從不同角度觀察可看到近似呈三角形，有明顯的孔溝，溝均細長。從金花茶花、葉的總離子圖中可觀察到金花茶葉子有33種活性成分，金花茶花朵則觀察到60種活性成分，與Nist譜庫匹配分析出金花茶富含醇和酚類物質，還包括酯類、有機酸類等，其中兒茶酚、天然維生素E等有效成分具有清除自由基的能力。說明金花茶葉、花微觀結構各異，并含有豐富的活性成分。這些研究數據有望為金花茶綜合利用提供一定借鑒，提高金花茶附加值。

關鍵詞：金花茶;微觀結構;活性成分;分析

中圖分類號：S685.140.1?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0221-04

收稿日期：2020-01-14

基金項目：廣東省自然科學基金面上項目（編號：2016A030307013、2019A1515011163）;2018國家大學生創新創業項目（編號：201810576005X）。

作者簡介：程金生（1976—），男，博士，副教授，主要研究方向為食品及藥物分析、天然藥物化學、納米醫學等。E-mail：86839680@qq.com。

通信作者：萬維宏，碩士，高級工程師，主要從事試驗設計、管理。E-mail：86839680@qq.com。

金花茶（Camellia chrysantha）是唯一一種花朵為金黃色又晶瑩透潤的山茶科植物，因胡先嘯博士的鑒定而得名 [1]。1984年，金花茶被列入國家一級保護植物之一，同時與其他3種珍稀植物齊名，它們分別是銀杉、桫欏、珙桐。金花茶在國內和國外都有著諸多美譽： “植物活化石”“茶族皇后”“幻想中的黃色山茶”等[2-3]。金花茶具有很高的藥用價值。近年來，學者對金花茶的科學項目研究愈來愈深入。一些研究者發現，金花茶富含許多對人體具有重要保健作用的有效成分，其中包括人類所必需的氨基酸和維生素、總皂苷、茶多酚類、齊墩果酸、黃酮類，還有微量元素等營養性或藥用活性成分[4-6]。

截至目前，尚無對金花茶葉、花等部位系統的微觀結構及活性成分的研究。尤其是對金櫻子花朵、花粉的微觀結構及活性成分的分析，目前尚未見任何文獻報道。本研究通過掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察了金花茶葉、花朵、花粉的微觀結構，并通過GC-MS分析了金花茶葉、花朵中脂溶性活性成分，為金櫻子種核綜合利用提供了一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

電熱鼓風干燥箱（101-1，紹興市嚴氏風機有限公司）、電子天平（XY600-2CS，常州市幸運電子設備有限公司）、萬分之一分析天平（DF22A，蘇州多賽電子天平有限公司）、高速多功能粉碎機（YB-2000A，浙江永康市速鋒工貿有限公司）、超細微粉粉碎機（FSJ-501，上海有建電子科技有限公司）、氣相色譜聯用儀[Agilent6890-5973，津工儀器科技（蘇州）有限公司]、紫外分光光度計（WFH-2038，上海精密科學儀器有限公司）、超聲波清洗器（KQ3200E，昆明市超聲儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（HH-6，江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠）、旋轉蒸發儀（IKA RV8，上海亞榮生化儀器廠）、臺式掃描電鏡（TM3030，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 主要試劑

防城港金花茶（南寧市田園之香食品店）、HF254硅膠（市售食品級，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司）、大孔樹脂（XAD-200，天津市海光化工有限公司），乙醚、乙醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純（阿拉丁化學試劑有限公司）。

1.3 試驗地點及時間

試驗地點：廣東省韶關市;試驗時間：2018年11月至2019年6月。

1.4 主要研究方法

1.4.1 茶多酚浸提、濃縮和純化 采用超聲波輔助浸提技術提取金花茶茶多酚，超聲波浸提的頻率為180 W，浸提溫度為70 ℃，浸提20 min。將超聲后的金花茶浸提液置于70 ℃的旋轉蒸發儀中，蒸發濃縮后得到茶多酚的粗提液。用XDA-200大孔樹脂進行茶多酚與雜質的分離和純化。首先用95%的乙醇浸泡樹脂24 h;然后用去離子水漂洗至無醇味后用茶多酚的粗提液以2.5 BV/h的流速過柱，待粗提液的出口濃度達到進口濃度的10%時，停止過柱，從而使大孔樹脂達到飽和狀態;最后設置濃度梯度乙醇洗脫達到純化的效果，其濃度分別為10%和30%，過柱流速為2.5 BV/h，得到茶多酚純化液。

1.4.2 金花茶葉、花微觀結構研究[7-8] 用掃描電鏡來觀察干燥后的金花茶的花朵和葉的微觀形態，以便觀察金花茶的組織結構。將金花茶的花朵和葉都剪成適合的小片狀，放入機器內，設置為真空狀態時觀察，并調整放大倍數與對焦，掃描出圖片。

1.4.3 金花茶活性成分GC-MS分析方法 氣相色譜柱程序升溫：第1步是從25 ℃的室溫以10 ℃/min 的速度來升溫，直到溫度升高到70 ℃為止，并在此溫度下保持2 min;第2步是將溫度升高到230 ℃，升溫速度為13 ℃/min;第3步是將溫度升高到280 ℃，升溫速度應為5 ℃/min，當溫度達到時在此溫度下保持12 min，并保持進樣口和檢測器（FID）溫度均為250 ℃;分流比為50 ∶1，柱流量為1 mL/min，載氣為高純氮氣。質譜條件：高純氦氣，EI離子源，電離電壓70 eV;離子源溫度為250 ℃，傳輸線溫度為250 ℃;掃描范圍為35～500 amu;質譜標準庫為Nist譜圖庫。

2 結果與討論

2.1 金花茶葉、花微觀結構研究

分別對金花茶的葉、花等部位微觀形態進行掃描電鏡觀察。由圖1-A可知，金花茶葉的顯微形態中，氣孔都分布在葉下表皮，每一片小區域都是由中心氣孔從圓心向外延伸，像孔雀開屏狀，外緣角質膜呈細條紋狀，在氣孔周圍無規則地連接著中心氣孔以及包圍著周圍的氣孔。從圖1-B可以看出，角質膜呈條紋狀同時有些許的顆粒感。氣孔器由2個像月牙的細胞構成，氣孔大多數呈橢圓形，表面平滑。從圖1-C、圖1-D可以看出，花朵的細胞呈長圓形，棱角圓滑，排列聯系緊密呈網狀，外側由較粗的條紋狀連接，內側為較細的條紋狀無規則的排列。從圖1-E、圖1-F可以看出，花粉的形態一般呈長球形，少數從不同角度觀察可看到近似呈三角形;有明顯的孔溝，溝均為細長，有些張開呈梭狀，外壁飾紋為穴狀飾紋。綜合上述的微觀結構分析可知，金花茶花、葉、花粉組織結構聯系比較緊密，細胞多呈類球狀，能承受較大程度上的物理研磨，且其飾紋結構單一，表面一般較光滑，在一定程度上會削弱外力的作用，因此在萃取活性成分時若僅靠機械研磨來使其內容物溶于提取劑的方法是不夠理想的。所以先經過多功能粉碎機研磨后再用超聲波萃取，能在一定程度上增加內容物的流出并更易溶于提取劑中。

2.2 金花茶活性成分的GC-MS分析

利用上述試驗方法對金花茶活性成分進行GC-MS 分析，其中定性分析是通過人工圖譜解析與Nist譜圖庫檢索，來確定活性成分的種類。定量分析則是使用面積歸一化法，來確定活性成分的含量，得出匹配率最高的化學成分及各成分的相對質量分數。活性成分的提取方法：將金花茶的葉經多功能粉碎機粉碎后，按料液比為1 g ∶3 mL的比值加入甲醇，為了能充分溶出活性物質需用超聲波處理3 h，超聲波的頻率設為80 W，超聲后過濾得到甲醇提取液，將甲醇提取液于旋轉蒸發儀中蒸發濃縮，最后將試驗所提取的濃縮液置于真空干燥箱中干燥12 h，溫度設置為40 ℃，得到其有效成分的萃取物。金花茶的花朵也用同樣的方法處理。

圖2為在上述條件下得出的金花茶葉的總離子圖，共檢測出33種活性成分，其中可與Nist譜庫匹配識別的活性物質有3-甲基戊烷、異戊酸、N-甲基吡咯烷酮、鄰苯二酚、4-乙烯基-2-甲氧基、苯酚、2，4-二甲氧基芐醇、十五烷酸、4-異丁基苯酚、1，1′-聯-2-萘酚、4-甲基兒茶酚、天然維生素E、蝦青素（表1）。

圖3是在上述條件下得出的金花茶花朵的總離子圖，共檢測出60種活性物質，其中可與Nist譜庫匹配識別的活性物質有糠醇、縮水甘油、甲基呋喃醛、苯酚、（S）-（-）-檸檬烯、環丁烷、甲基草甘膦、3-辛炔-1-醇、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、3-甲基-2，3，4，5-四氫-2，4-呋喃二酮、（S）-（+）-檸蘋酸、丁酸辛酯、1，6-脫水吡喃葡萄糖、對羥基苯甲酸、月桂酸、十五烷酮、鄰苯二甲酸二異丁酯、反式-2-十二烯酸、十二烷二醇、正十五酸、順式-十八碳烯酸、反油酸乙酯、豆固醇等（表2）。

3 結論

金花茶的組織結構聯系緊密，應先經過多功能粉碎機研磨后再用超聲波萃取，能在一定程度上增加內容物的流出并更易溶于提取劑中，有利于后續制粒的操作步驟。在GC-MS分析中，金花茶葉子可檢測出33種活性成分，而花朵可檢測出60種活性成分，其中包括一些具有較好抗氧化作用的有效成分，如兒茶酚、天然維生素E等，有望作為抗氧化制劑的良好原料。

參考文獻：

[1]胡先嘯. 雕果茶屬——山茶科一新屬[J]. 植物分類學報，1965，10（1）：25-26.

[2]孔桂菊，袁勝濤，孫 立. 金花茶藥理作用研究進展[J]. 時珍國醫國藥，2016，27（6）： 1459-1461.

[3]廣西植物研究所. 廣西植物雜志[M]. 南寧：廣西科學技術出版社，1965.

[4]Xiong Z C，Qi X X，Wei X，et al. Nutrient composition in leaves of cultivated and wild Camellia nitidissima[J]. Pakistan Journal of Botany，2012，44（2）： 635-638.

[5]Qi J，Shi R，Yu J，et al. Chemical constituents from leaves of camellia nitidissima and their potential cytotoxicity on SGC7901 cells[J]. Chinese Herbal Medicines，2016，8（1）： 80-84.

[6]曹 芬，燓蘭蘭. 金花茶研究進展[J]. 中國藥業，2013，22（4）：95-96.

[7]汪小蘭. 幾種金花茶花粉的掃描電鏡觀察[J]. 武漢植物學研究，1985（2）：131-135，203-206.

[8]王任翔，胡長華，梁盛業，等. 金花茶組植物葉表皮特征的掃描電鏡觀察[J]. 廣西林業科學，2002（3）：133-136.