甘蔗近緣野生種蔗茅EfGRAS基因克隆及表達分析

沈先岳 谷書杰 謝林艷 錢禛鋒 曾丹 何麗蓮 李富生

摘? 要：為深入挖掘甘蔗品種的抗旱性能，本研究挑選甘蔗品種中參與調控抗旱機制的主要轉錄因子GRAS的基因進行表達分析。從轉錄組數據庫中調取GRAS轉錄因子基因序列信息，采用RACE-PCR和qRT-PCR技術從‘蔗茅99-2中克隆得到1個GRAS基因，將其命名為EfGRAS（GenBank登錄號MT499789），并對其進行生物信息學分析與干旱脅迫表達分析。結果表明，EfGRAS基因編碼547個氨基酸，CDS全長1644 bp，該蛋白的分子式為C2645H4149N747O816S21，相對分子質量為60.14 kDa，不穩定系數為54.85，脂肪系數為84.37，GRAVY值為?0.293，是一類不穩定蛋白和親水蛋白;亞細胞定位表明其位于細胞核內，EfGRAS蛋白主要的二級結構是α-螺旋和無規則卷曲，與高粱親緣關系最近;qRT-PCR分析顯示，受到干旱脅迫后，‘蔗茅99-2中基因表達量相比于對照組上調約57.6倍，‘滇蔗01-58中基因表達量相比于對照上調約27.4倍，‘崖城89-9中基因表達量相比于對照組上調倍數較低。本研究結果為進一步研究EfGRAS基因在甘蔗中的功能提供理論基礎。

關鍵詞：蔗茅;干旱脅迫;EfGRAS基因;克隆;表達分析

中圖分類號：S566.1;Q78? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to make deeper research into the drought resistance of sugarcane varieties， the genes of GRAS which playing an important role in the regulation of drought resistance mechanisms in sugarcane varieties for expression analysis were studied. In this experiment， we firstly retrieved the GRAS transcription factor gene sequence information from the transcriptome database， and used RACE-PCR and qRT-PCR techniques to clone a GRAS gene from ‘Sucrose 99-2 and namde it EfGRAS （GenBank registration No. MT499789）， then the bioinformatics analysis and expression analysis under drought stress were conducted on the EfGRAS gene. The results showed that the EfGRAS gene could encode 547 amino acids with a CDS 1644 bp in length， the molecular formula of the protein was C2645H4149N747O816S21， the relative molecular mass was 60.14 kDa， the instability coefficient was 54.85， the fat coefficient was 84.37， and the GRAVY value was ?0.293， which was a class unstable and hydrophilic protein. The subcellular location indicated that it was located in the nucleus. The main secondary structure of EfGRAS protein was α-helix and random coils， which were closely related to sorghum; qRT-PCR analysis showed that after drought stress， the gene expression in ‘Sugarcane 99-2 was up-regulated by about 57.6 times compared to the control group， and the gene expression in ‘DZ 01-58 was up-regulated by about 27.4 times compared to the control group. Compared with the control group， the gene expression level in ‘YC 89-9 had a lower fold of up-regulation. The results would provide a theoretical basis for the further study on the function of EfGRAS in sugarcane.

Keywords： Erianthus fluvus; drought stress; EfGRAS gene; clone; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.017

甘蔗（Saccharum spp.）是禾本科多年生熱帶作物，屬于無性繁殖的C4作物，其種植最早起源于中國[1-2]。作為主要的制糖類經濟作物，在我國南方地區甘蔗種植面積較廣[3-4]。中國85%左右的甘蔗種植面積為旱地，干旱成為限制中國甘蔗生產的首要環境因素[5]。干旱嚴重影響了甘蔗的產量和品質，隨著甘蔗品種抗旱性能研究的不斷深入，選育出高產、穩產、抗旱能力強的甘蔗品種及挑選最佳的親本材料成為我國目前甘蔗研究的首要任務[6]。蔗茅（Erianthus fulvus Ness.）是禾本科甘蔗亞族蔗茅屬的一個野生種，具有早熟、含糖量高、抗逆性強等特點[7]，其在高海拔寒冷的氣候條件下和干旱嚴峻的荒坡上都可以生長，甚至在陡峭的石壁巖縫和成土母質上也可見到蔗茅，表現出極強的抗寒、抗旱和耐瘠能力，宿根性強、抗銹病等優異特性，容易開花且花粉量極多，目前只在中國收集、保存并展開相關的研究，是一種極其珍貴的種質資源[8-10]。

GRAS轉錄因子只在植物中存在，GRAS蛋白擁有著獨特的結構域，根據對模式植物擬南芥和水稻的GRAS基因家族遺傳分析，可將GRAS基因家族劃分為8個亞族（LISCL、PATI、SCL3、DELLA、SCR、SHR、LS和HAM），其中擬南芥、水稻、煙草、胡楊、大白菜、佛手、辣椒和獨行菜的GRAS家族基因響應了干旱、低溫和激素等脅迫。馬洪雙等[11]從胡楊中得到抗旱基因PeSCL7，包含可能與干旱脅迫、病害脅迫等應答元件。張煥欣等[12]利用生物信息學方法進行系統鑒定和進化分析表明，辣椒的大部分GRAS家族基因能夠響應PEG6000和鹽脅迫。楊輝等[13]從煙草品種NC89克隆的NtGRAS在低溫（4 ℃）、NaCl（200 μmol/L）和干旱下均可誘導NtGRAS基因表達上調。殷龍飛等[14]以玉米為材料，發現ZmGRAS31在玉米中響應了抗旱、抗寒及抗鹽等逆境脅迫，推測ZmGRAS31可提高玉米的抗逆性。韓雯毓等[15]利用qRT-PCR技術檢測干旱和鹽脅迫下蓖麻根、莖和葉不同組織中5個基因的表達，發現RcGRASs在不同組織中的表達存在差異性，其中RcGRAS14、RcGRAS21、RcGRAS35的基因表達量上調，RcGRAS1、RcGRAS10的基因表達下調。

研究甘蔗野生種蔗茅的抗旱相關基因，對未來提高甘蔗產量、品質有著重要意義。本研究以‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58和‘崖城89-9及其轉錄組數據為試驗材料和基礎，對EfGRAS基因進行克隆以及生物信息學分析，同時采用qRT-PCR技術檢測干旱脅迫下EfGRAS基因的表達情況，以期為甘蔗抗旱機制的后續研究提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58和‘崖城89-9，均由云南農業大學甘蔗研究所提供，在材料苗期分別取其對照組（正常澆水）及處理組（干旱脅迫處理）的+1葉。取樣時間為9：00，剪取后立即放入?80 ℃冰箱保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取及cDNA鏈合成? 利用TRNzol Universa試劑盒提取總RNA，cDNA鏈的合成利用FastKing一步法合成反轉錄cDNA試劑盒。

1.2.2? 引物設計及基因表達分析? 根據基因的序列，qRT-PCR使用NCBI Primer Blast以及Primer 5.0設計其引物，內參基因選用闕友雄等[16]設計的25S引物序列，具體見表1。

PCR程序采用兩步法在ABI-7500儀器上進行qRT-PCR。反應程序為：95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，采集熒光信號共40個循環，每個樣品設置3個重復。反應結束后從qRT-PCR的擴增曲線中得到Ct值，采用2?Ct算法計算差異表達基因的相對表達量。

1.2.3? EfGRAS基因克隆? 根據EfGRAS基因的序列，使用NCBI在線軟件Home-ORF Finder找到基因的開放閱讀框，然后通過NCBI的Primer- BLAST設計目的基因的擴增引物（表2）。基因擴增的PCR反應程序為：98 ℃ 20 s;98 ℃ 10 s，53 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 10 min。

1.2.4? EfGRAS基因生物信息學分析? EfGRAS蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點利用Protparam在線軟件分析;EfGRAS蛋白的親疏水性利用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件進行預測分析;利用ProtComp Version 9.0對EfGRRAS蛋白亞細胞定位進行分析;通過NCBI的CDD（conserved domain database）進行結構域預測;利用SOPMA軟件對EfGRAS蛋白的二級結構進行分析;利用Swiss- modle在線軟件對EfGRAS蛋白的三級結構進行預測;通過NCBI的Blastx進行搜索不同物種間氨基酸序列，再利用DNAMAN 6.0進行同源性分析，系統進化樹由MEGA7.0軟件構建。

2? 結果與分析

2.1? RNA的檢測結果

提取正常澆水及干旱脅迫處理的‘蔗茅99-2‘滇蔗01-58‘崖城89-93種材料苗期的RNA進行紫外分光光度計檢測，檢測后發現RNA樣品的OD260/280均在1.8～2.0左右，純度較高，如圖1所示。

2.2? EfGRAS基因克隆

以cDNA為模板，根據編碼區起始端、終止端序列設計的特異引物進行基因編碼區PCR擴增，將PCR產物經1%瓊脂糖TAE凝膠電泳，EfGRAS基因在1769 bp處顯示出1條清晰條帶（圖2），與預期結果一致。

2.3? EfGRAS基因生物信息學分析

2.3.1? EfGRAS轉錄因子的氨基酸組成及理化性質分析? 將測序結果在NCBI上進行ORF Finder分析，結果發現有12個大小不同的ORF，其中最長的一個ORF有一個起始密碼子ATG，終止密碼子TAG，編碼547個氨基酸，CDS全長1644 bp（圖3）。利用ProParam在線軟件對該基因編碼蛋白質的氨基酸序列進行基本性質的分析：該蛋白的分子式為C2645H4149N747O816S21，相對分子質量為60.14 kDa，由C、H、N、O、S 5種原子組成，共有8378個原子;該蛋白不穩定系數為54.85，脂肪系數為84.37，GRAVY值為?0.293，是一類不穩定蛋白。

2.3.2? EfGRAS蛋白親疏水性及保守結構域? 利用ProScale在線軟件進行親疏水性分析，標度值<0的區域比>0的較為密集（圖4），結合GRAVY值，預測該蛋白為親水蛋白;對EfGRAS基因編碼蛋白進行保守結構域預測分析，該蛋白含有1個典型的GRAS結構域（圖5）。

2.3.3? EfGRAS蛋白亞細胞定位及序列比對分析? 使用ProtComp Version 9.0對EfGRRAS蛋白進行亞細胞定位分析，從分析結果可以看出，該蛋白位于細胞核的積分值為5.93（表3），從而可以推測該蛋白定位于細胞核內的可能性較大。利用Blastx分析，與EfGRAS蛋白序列相似性高的蛋白序列有高粱（Sorghum bicolor）（96.71%）、糜子（Panicum miliaceum）（93.60%）、狗尾草（Setaria italica）（93.24%）、玉米（Zea mays）（92.78%）、佛肚竹（Bambusa ventricosa）（83.36%）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）（81.67%）、水稻（Oryza sativa Japonica Group）（81.17%）、黃麻（Corchorus capsularis）（65.80%）、油棕（Elaeis guineensis）（65.29%），利用DNAMAN 6.0將EfGRAS基因進行同源蛋白比較，結果見圖6。

2.3.4? EfGRAS蛋白進化樹分析及結構分析? MEGA 7軟件分析的結果顯示，EfGRAS蛋白與高粱親緣關系最近，其次是玉米（圖7）。SOPMA軟件分析結果表明，該蛋白由α-螺旋（alpha helix） （43.51%）、延伸主鏈（extended strand）（10.97%）、β-轉角（beta turn）（4.39%）和無規則卷曲（random coil）（41.13%）構成，總的來看，EfGRAS蛋白主要的二級結構是α-螺旋和無規則卷曲。EfGRAS蛋白的三級結構預測如圖8所示。

2.4? EfGRAS基因在干旱脅迫下的定量表達分析

從圖9可看出，干旱脅迫處理下，EfGRAS基因不同材料中的表達量有顯著性差異。受到干旱脅迫后，‘蔗茅99-2基因表達量相比于對照組上調約57.6倍，‘滇蔗01-58上調約27.4倍，‘崖城89-9上調倍數較低。受到干旱脅迫后經過實時熒光定量PCR發現基因表達量都呈現不同程度的遞增，其中甘蔗野生種‘蔗茅99-2中的基因表達量前后增幅最大，其次是雜交種‘滇蔗01-58。

3? 討論

3.1? EfGRAS基因表達量分析

目前，關于GRAS蛋白的抗旱研究中，發現少數GRAS蛋白參與非生物應激反應。郭華軍等[17]以擬南芥為試驗材料，并通過生物信息學技術和全基因組芯片分析發現在滲透和干旱脅迫時有10個GRAS家族基因表達量顯著上調，然后利用功能基因組平臺，初步發現SCL13基因可能在應答過程中參與了ABA依賴型信號轉導途徑。李亞飛等[18]通過轉錄組數據分析了在熱脅迫和干旱脅迫下小麥中GRAS基因的表達量的差異，發現該基因在響應干旱脅迫的過程中起著關鍵的作用。Xu等[19]探究了GRAS轉錄因子基因OsGRAS23的抗旱能力，結果表明過表達OsGRAS23的水稻植株與野生型水稻相比，具有更強的抗旱性和抗氧化能力。Ma等[20]為探究GRAS的抗旱性和耐鹽性，從胡楊中分離出PeSCL7基因，研究發現PeSCL7基因在擬南芥中的過表達顯示出提高了耐旱性和耐鹽性。Czikkel等[21]研究發現NtGRAS1與煙草的抗旱性相關，在干旱脅迫下NtGRAS1表達被誘導。

研究表明，EfGRAS基因受到干旱脅迫后能被誘導，基因表達量均表現上調，但在‘蔗茅99-2‘崖城89-9‘滇蔗01-58中的上調倍數不同，其中在‘蔗茅99-2中EfGRAS基因上調倍數最大，本研究與前人研究結果基本一致，推測EfGRAS在參與蔗茅干旱脅迫響應過程中起正調控的作用。

3.2? EfGRAS轉錄因子抗旱性克隆分析

GRAS蛋白是一個多功能蛋白質，參與許多生物學過程，除參與植物的生長發育外，也已經鑒定發現多種GRAS轉錄因子具有抵抗不同非生物脅迫的功能。Li等[22]發現BrLAS編碼一種脅迫反應的GRASs轉錄因子，該因子可正向調節干旱脅迫的耐受性。Liu等[23]以辣椒為試驗材料發現，在冷害、干旱、鹽和赤霉素（GA）處理下，有21種CaGRAS基因差異表達，表明它們可能與植物對非生物脅迫的反應有關。粟莉圓等[24]在熱脅迫下，JrGRAS2基因被顯著誘導，發現轉JrGRAS2基因酵母表現出較對照更高的生存活性，表明JrGRAS2基因具有響應熱脅迫的能力且能提高酵母的抗性，JrGRAS2基因可作為核桃逆境應答的重要候選基因。韓菲等[25]以“富士×特拉蒙”雜交后代柱型株系新梢為試材，用同源克隆方法，得到了柱型蘋果GRAS基因家族的MdSCR基因。李阿英等[26]以擬南芥SCL6和楊樹GRAS cDNA 序列作為模板，對柑橘EST數據庫進行同源檢索篩選出柑橘SCL6和GRAS基因的cDNA序列，并以枳花cDNA為模板，利用5 RACE和3 RACE技術獲得枳的SCL6和GRAS cDNA全長，分別命名為Pt-SCL6和Pt-GRAS。

本研究結果可以推測出EfGRAS可能是一個抗旱基因，通過對蔗茅EfGRAS基因的克隆、生物信息學分析，確定該蛋白不穩定系數為54.85，脂肪系數為84.37，GRAVY值為?0.293，是一類不穩定蛋白，EfGRAS蛋白與高粱親緣關系最近，主要的二級結構是α-螺旋和無規則卷曲，為進一步深入研究EfGRAS基因的功能奠定了基礎。

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