婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病的防效及根際微生物的影響

劉琴 徐健 祁建杭 劉懷阿 李傳明 韓光杰 徐彬 陸玉榮 孫俊

摘要：為明確婁徹氏鏈霉菌對番茄枯萎病的防效及根際微生物類群的影響，采用室內盆栽灌根法測定婁徹氏鏈霉菌SR-1102菌株對番茄枯萎病病菌的防治效果，分析SR-1102對番茄根圍、根表土壤及根系微生物類群、數量的影響。結果表明，SR-1102 50倍液、100倍液灌根處理對番茄枯萎病的防治效果達69.10%～72.84%。SR-1102能促進番茄根際微生物的增長，根圍、根表微生物數量較對照分別增加0.6倍和2.1倍以上。根際土壤微生物增殖以細菌、放線菌為主，而真菌增殖受到抑制，根圍、根表真菌數量較對照減少了24.9%～42.2%。SR-1102灌根處理可顯著改變番茄根際微生物類群結構，根圍、根表的放線菌/真菌、細菌/真菌較對照分別提高了7.8～9.0倍和2.8～3.5倍。定殖試驗結果進一步表明，SR-1102在番茄根圍、根表和根系都能定殖，根表定殖率較高，不同濃度SR-1102處理的定殖率達69.05%～75.57%。

關鍵詞：婁徹氏鏈霉菌;番茄枯萎病;防效;微生物類群

中圖分類號：S436.412文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1133-06

Abstract： To explore the control effect of Streptomyces rochei SR-1102 on Fusarium wilt of tomato and the impact on rhizosphere microorganisms， the root-irrigating method was used in this study. The results indicated that the control effect of SR-1102 diluted with 50 and 100 times solution on Fusarium wilt of tomato ranged from 69.10% to 72.84%. SR-1102 could promote the growth of rhizosphere microorganisms， and the number of microorganisms in rhizosphere and root surface increased 0.6 times and 2.1 times. Bacteria and actinomycetes were the main microorganisms in rhizosphere soil， while fungi group was inhibited. Compared with the control， the number of fungi in rhizosphere and root surface decreased by 24.9%-42.2%. SR-1102 could significantly change the microbial community structure of tomato rhizosphere. The actinomycetes/fungi and bacteria/fungi in rhizosphere and root surface were increased by 7.8-9.0 times and 2.8-3.5 times， respectively. The results of colonization test revealed that SR-1102 could be colonized in the rhizosphere， root surface and root system of tomato. The colonization rate was high in root surface， and the colonization rate of SR-1102 ranged from 69.05% to 75.57%.

Key words：Streptomyces rochei;tomato Fusarium wilt;control effect;microbial group

番茄枯萎病是危害番茄生長的土傳真菌病害，其病原為半知菌亞門番茄專化型尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici Snyder et Hansen）[1]。土壤中的病原菌通過番茄根部侵染并在維管束繁殖，引起維管束阻塞，導致植株萎蔫、枯死，成為番茄栽培中危害損失大、防治困難的重要病害[2]。設施番茄栽培技術的推廣及連茬種植，加重了番茄枯萎病的發生和危害，制約了番茄產業的高效、可持續發展[3]。長期以來包括番茄枯萎病在內的土傳病害主要依賴化學防治，但大量農藥的使用并未從根本上有效控制番茄枯萎病的危害，同時造成病原菌抗藥性增強、蔬菜農藥殘留增加及土壤微生物生態的惡化。植物根圍土壤中廣泛存在的能產生拮抗性物質、抑制病原菌侵染、促進植物生長的微生物，是經濟有效的生防資源[4-6]。分離篩選廣譜、高效拮抗菌，探索利用根際有益微生物防治土傳病害的生物防治途徑，對推進農業可持續發展具有重要作用[7-9]。婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）是自然界廣泛存在的一種生防放線菌，在番茄、辣椒、印楝等多種植物組織內被分離獲得[10-12]。江蘇里下河地區農業科學研究所從黃瓜根莖分離獲得的內生放線菌（Actinomycete）婁徹氏鏈霉菌 SR-1102菌株，表現出對黃瓜枯萎病病菌、茄子黃萎病病菌、番茄灰霉病病菌等多種靶標真菌的拮抗活性[13]。本研究采用盆栽試驗法，研究婁徹氏鏈霉菌SR-1102灌根對番茄枯萎病的生防效果及番茄根際微生物區系的影響，為應用婁徹氏鏈霉菌防治番茄枯萎病、改善連作土壤種植生態、克服土傳病害危害提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試菌株和培養基供試婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）SR-1102菌株由江蘇里下河地區農業科學研究所從黃瓜根際分離獲得，實驗室鑒定并保存[13]。病原菌番茄枯萎病病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici Snyder et Hansen）由江蘇省農業科學院植物保護研究所提供，實驗室活化、搖瓶培養后供盆缽接種。

培養基包括高氏一號瓊脂培養基（GA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）、馬鈴薯蔗糖培養液（PSB）、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基（BPA）。培養基配制參照方中達[14]的方法。

1.1.2供試材料供試番茄（Solanum lycopersicum）品種為蘇粉14號，選取長勢相同的2葉1心穴盤番茄幼苗作為供試植株。

婁徹氏鏈霉菌SR-1102發酵液：婁徹氏鏈霉菌SR-1102菌株在高氏一號斜面培養基活化5 d后，接種到50 ml發酵培養基（1 L配方：玉米粉30.0 g、K2HPO4 2.0 g、MgCl2 2.0 g和NaCl 1.0 g，蒸餾水1 000 ml）中，30 ℃振蕩培養4 d，收集菌液，孢子濃度為1 ml 2×109 CFU。

番茄枯萎病病菌接種液：將保存在PDA斜面培養基上的番茄枯萎病病菌接種于100 ml PSB液體培養液中，28 ℃振蕩培養5 d產生孢子。培養液用紗布過濾、離心去除上清液后，用無菌水稀釋成孢子濃度為1 ml 1×107 CFU的病菌接種液。

1.2試驗方法

1.2.1婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病的防效試驗取蔬菜田15～25 cm土層，去除石子、草根，105 ℃烘干2 h后裝入塑料盆缽（d=14.0 cm）中。將2葉1心番茄幼苗根部用清水洗凈，放入番茄枯萎病病菌孢子接種液中浸泡20 min，每盆移栽1株，溫室內培養。移栽1 d后分別用SR-1102發酵液50倍液、100倍液50 ml灌根，另以等量清水灌根為對照。3次重復，每個重復30株。

番茄幼苗SR-1102發酵液灌根30 d后調查番茄枯萎病發病株數，計算病株率，參考番茄枯萎病分級標準[15]，調查病情指數，計算相對防效。

1.2.2婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄根際微生物類群的影響方法1.2.1中番茄盆缽SR-1102灌根60 d后，各處理隨機選擇4盆植株。抖落附著在番茄根系上的土，定量稱取土樣，以無菌水定容作為根圍土樣;剪取上述取過根圍土的根系，用無菌水洗滌根表土壤，以洗滌前后根質量差值計算土樣并定容作為根表土樣;洗滌番茄根系經75%乙醇浸泡30 s、1 g/L氯化汞處理1.5 min、無菌水洗滌后，于無菌研缽中加無菌水研磨后定容作為根系樣品[16]。不同樣品以無菌水稀釋成不同濃度梯度，采用稀釋平板測數法進行土壤微生物分離和計數[17]。真菌用PSA培養基（含0.3%鏈霉菌）28 ℃培養4 d計數;細菌用BPA培養基30 ℃培養3 d計數;放線菌用GA培養基（含80 μg/ml K2Cr2O7）30 ℃培養4 d計數。SR-1102的確認主要通過與SR-1102菌株同步純培養的菌落形態比較和16S rDNA鑒定后計數。

2結果與分析

2.1婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病的防治效果

盆栽接種番茄枯萎病病菌試驗結果表明，番茄枯萎病病菌對番茄幼苗具有較強的侵染能力，番茄枯萎病病菌接種30 d后，盆缽番茄都有不同程度的感染，清水對照的病指為73.61，病株率達100.00%。放線菌 SR-1102 灌根處理對番茄枯萎病具有較好防效，50倍液、100倍液處理30 d后，病指分別為20.00、22.78，病株率分別為66.67%、68.89%，顯著低于清水對照，相對防治效果分別達72.84%、69.10%。不同濃度SR-1102處理間病指、病株率、相對防效的差異不顯著（表1）。

2.2婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄根際微生物類群的影響

2.2.1婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄根際微生物數量的影響番茄根際土壤微生物主要分布在根圍和根表土壤中，其中根表微生物數量最大（圖1A）。不同濃度SR-1102灌根處理都顯著促進了番茄根圍、根表微生物的增長，根圍微生物數量較對照增加了0.6～0.9倍，根表微生物數量增加了2.1倍以上，與對照差異顯著。細菌是根際土壤微生物的主要類群，根系內定殖的微生物也以細菌為主。SR-1102灌根處理后，番茄根圍、根表土壤中細菌數量顯著增加，但對根系內細菌定殖量無明顯影響（圖1B）。SR-1102灌根處理后番茄根際放線菌增長量主要集中根圍和根表，較對照增加了137.3%～562.2%，同時提高了番茄根系內放線菌定殖量（圖1C）。相反，番茄根際土壤中真菌增殖受到抑制，SR-1102灌根處理后根系內未檢測到真菌定殖，根圍、根表真菌數量較對照顯著減少了24.9%～42.2%（圖1D）。

2.2.2婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄根際微生物類群的影響婁徹氏鏈霉菌不僅促進了番茄根際微生物數量的增長，而且對根際土壤微生物類群的結構產生影響，與對照相比，SR-1102灌根處理的土壤中A/B（放線菌/細菌）、A/F（放線菌/真菌）、B/F（細菌/真菌）的變化明顯，表現為放線菌與細菌類群相對提高、真菌類群相對降低（表2）。番茄根際不同區域微生物類群測定結果表明，SR-1102灌根處理后根表土壤中微生物類群結構變化較大，A/F、B/F較對照分別提高了7.8～9.0倍和2.8～3.5倍。放線菌類群在根表土壤中的增長比例明顯高于根圍土壤，不同濃度SR-1102灌根處理根表土壤中A/B、A/F較根圍土壤分別提高了0.5～0.6倍和1.3～1.7倍。不同濃度SR-1102灌根處理間微生物類群結構A/B、A/F、B/F差異不顯著

2.3婁徹氏鏈霉菌SR-1102在番茄根際的定殖作用

與SR-1102菌株同步純培養形態比較結合16S rDNA驗證結果表明，從婁徹氏鏈霉菌SR-1102灌根處理的番茄植株根圍、根表和根系普遍分離獲得婁徹氏鏈霉菌SR-1102，說明婁徹氏鏈霉菌SR-1102在番茄根際具有較強的存活、定殖能力。根圍、根表土壤是SR-1102增殖和優勢菌群形成的主要區域，不同濃度SR-1102灌根處理60 d后，從土壤中分離的SR-1102數量分別達到9.42×105 ～1.17×106 CFU/g和4.67×106 ～5.43×106CFU/g，根表定殖率較高，為69.05%～75.57%，與根圍定殖率無明顯差異，但顯著高于根系的定殖率。根系內SR-1102定殖數量較少，僅37.50～75.00 CFU/g，定殖率為8.33%～11.51%。SR-1102表現為隨SR-1102處理濃度的提高，定殖量相對增加，但方差分析差異不顯著（表3）。

3討論

大量研究結果表明，放線菌能通過代謝抗生素、誘導植物抗性來抑制病原菌對植物的侵染，在蔬菜土傳病害生物防治上具有廣泛的應用潛能[18]。灰綠鏈霉菌K61是從泥炭蘚中分離的放線菌，能顯著抑制康乃馨枯萎病病菌的侵染和擴展，同時誘導植株增強系統抗性[19]。西北農林科技大學篩選的生防放線菌Act11、Act12在植物根部具有較好的定殖穩定性，能夠促進根際微生物類群結構的改善，形成以放線菌、拮抗細菌為優勢菌群的抵抗病原菌侵染的生物屏障[20]。婁徹氏鏈霉菌是植物根際及土壤中廣泛分布的生防放線菌。筆者的前期研究結果表明，分離獲得的SR-1102菌株具有廣譜拮抗活性，對黃瓜枯萎病病菌、西瓜枯萎病病菌、茄子黃萎病病菌等多種植物病原真菌具有較好的抑菌效果[13]，田間試驗結果表明，SR-1102對番茄立枯病、黃瓜立枯病等土傳病害有較好的防效[21]。本試驗結果進一步表明，婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病同樣具有較好的拮抗作用，能夠顯著降低感病株率、病情指數，不同濃度SR-1102灌根處理對番茄枯萎病的相對防治效果達69.10%～72.84%。同時SR-1102是植物內生放線菌，能夠在植物根際形成有效定殖，在接種番茄枯萎病病菌的土壤中灌根60 d后，番茄根圍、根表、根系中都普遍檢測到SR-1102菌株，根圍、根表土壤表現出較高的定殖率，這對婁徹氏鏈霉菌SR-1102在番茄根際占據生態位、競爭抑制枯萎病病菌的侵染具有重要作用。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，不僅直接影響植物的生長狀況，而且是反映土壤生態活性的指標[22]。土壤微生物的區系組成、生物量及其生命活動與土壤的質量和植物生長密切相關 [16，23]。江蘇設施蔬菜連作土壤理化性狀分析研究結果表明，連作種植土壤中微生物類群的變化是造成設施蔬菜連作障礙的主要生物因素之一 [24]。番茄枯萎病是一種土壤帶菌侵染的土傳病害，設施連茬栽培加重了包括番茄枯萎病在內的多種土傳病害危害，致使設施番茄種植產生連作障礙 [25-27]。長期連作直接影響微生物在土壤中的消長和活性，表現為細菌數量下降和放線菌增長變緩，而病原真菌數量持續上升，導致土傳病害加重[28-29]。通過向土壤中添加有益微生物可以顯著改變微生物類群的結構，減少土傳病害的發生和危害，克服連作障礙的影響[30]。本試驗結果表明，番茄根際婁徹氏鏈霉菌SR-1102的引入對土壤微生物生態產生顯著影響，在促進番茄根際微生物的數量增長的同時，改變了微生物的類群結構，根圍、根表微生物數量分別較對照增加了0.6倍、2.1倍。根際土壤微生物數量增加的主要類群是細菌、放線菌，而真菌增殖受到抑制，根圍、根表真菌數量較對照減少了24.9%～42.2%，使得A/B、A/F、B/F顯著提高。在應用植物內生放線菌SR-1102防治番茄枯萎病的同時，可以通過放線菌的定殖調控作用，優化土壤微生物結構，提高根際土壤微生態質量，降低多種土傳真菌危害風險，說明植物內生放線菌防治方法是蔬菜土傳病害標本兼治的生物治理途徑。

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（責任編輯：陳海霞）