新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳分化與變異特征

于少帥 趙文霞 姚艷霞 張學超 淮穩霞

摘要：利用15對特異性SSR引物對290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品進行擴增，并通過分子生物學方法分析其遺傳變異特征與系統發育關系。15對SSR引物在290份新疆野蘋果和栽培蘋果樣品中共獲得69個等位基因，平均每個SSR位點獲得4.6個等位基因。新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，遺傳分化系數為0.25，基因流為0.76。新疆新源和鞏留2個地區的新疆野蘋果聚于一個進化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個進化分枝。編碼轉錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質N端、轉錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。

關鍵詞：新疆野蘋果;微衛星標記;遺傳多樣性;系統發育;抗逆性

中圖分類號：S661.1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）05-1274-08

Abstract： 15 pairs of specific simple sequence repeats（SSR） primers were used to amplify 290 samples of Malus sieversii and cultivated apples， and their genetic variation and phylogenetic relationships were analyzed by molecular biology method. 69 alleles were obtained in 290 samples of M. sieversii and cultivated apples based on 15 pairs of SSR primers， with an average of 4.6 alleles per SSR locus. There was a close genetic relationship between M. sieversii and cultivated apples. The genetic diversity of M. sieversii groups was rich， with a genetic differentiation coefficient of 0.25 and a gene flow of 0.76. M. sieversii from Xinyuan and Gongliu of Xinjiang clustered in an evolutionary branch， cultivated apples and the red-flesh apple collected from Xinjiang clustered in an evolutionary branch. The SSR locus that coding transcription factor RAX3 showed a specific band in M. sieversii samples whose deadwood rate was above 90%. The SSR locus that coding the N end of the TMV-like resistant protein showed a specific band in M. sieversii samples. The SSR loci that coding the N end of the TMV-like resistant protein and the transcription factor bHLH74 showed specific bands in cultivated apples.

Key words：Malus sieversii;microsatellite marker;genetic diversity;phylogeny;stress resistance

新疆野蘋果（Malus sieversii）是薔薇科蘋果屬的瀕危二級重點保護植物，是研究世界蘋果遺傳多樣性和基因進化的重要天然基因庫，主要分布于中國新疆西部、中亞的哈薩克斯坦和吉爾吉斯斯坦[1]。新疆野蘋果由于受自然選擇的長期作用，形成了豐富的遺傳特征和較強的環境適應性，具有抗病、抗蟲等優良性狀[2]。近年來，分布于中國的新疆野蘋果枯死嚴重。影響新疆野蘋果生存狀態的原因較多，比如人類活動、蘋小吉丁蟲害和蘋果樹腐爛病等因素[3-5]。但關于引起新疆野蘋果枯死的具體原因及枯死機制尚不清楚。因新疆野蘋果脅迫因子的多樣性和復雜性，在新疆野蘋果保育過程中采取單一的防治手段較難起到理想的保護效果。在尋找引起新疆野蘋果種群退化的關鍵因子和保護新疆野蘋果的同時，保護、選育和栽培具有抗性特征的遺傳資源應該是控制其種群衰退最為經濟有效和根本的措施。

關于新疆野蘋果種質遺傳變異和系統發育的研究結果表明，新疆鞏留縣、新源縣等地的新疆野蘋果種群存在豐富的遺傳多樣性[6-7]，種群內部遺傳分化程度較高[8]。在新疆野蘋果遺傳多樣性和系統發育關系研究中常用的分子標記有SSR[9]、SRAP[7]、RAPD[10]、ITS[11]，其中應用較多的分子標記為SSR標記[2]。作為一種分辨率高、遺傳信息量大、操作相對簡單的標記方法，SSR被廣泛應用于瀕危植物遺傳變異研究中[12-14]。SSR標記可以與植物的一些表型、抗性等性狀關聯在一起。Klabunde等[15]用11對SSR引物對152份具有不同蘋果葉斑病抗性的巴西栽培蘋果的遺傳多樣性進行評估發現：不同抗性栽培蘋果間存在豐富的遺傳多樣性，蘋果抗葉斑病品種與感葉斑病品種間遺傳結構差異顯著，有120個等位位點是抗病品種獨有的。新疆野蘋果研究結果顯示，SSR標記可以很好地揭示新疆野蘋果種群遺傳多樣性和遺傳結構[6]，新疆野蘋果種內不同個體的葉形等表型性狀的變異與SSR標記的位點有一定的相關性[2，16]。目前關于新疆野蘋果抗病蟲等抗性差異在新疆野蘋果個體、種群間的遺傳變異尚未見報道。

新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關系較近，可能是現代栽培蘋果的祖先[1]。目前關于新疆野蘋果種質遺傳變異和系統發育研究應用較多的分子標記是SSR標記[6，9，16]，但現在大部分標記均為非編碼區分子標記，擴增片段的功能未知，在NCBI上無明確比對結果。基于栽培蘋果基因組，篩選了15對可以在栽培蘋果、新疆野蘋果中擴增出目的條帶的的特異性SSR引物，通過這些特異性引物對不同種群新疆野蘋果和栽培蘋果進行遺傳變異分析，旨在揭示新疆野蘋果的遺傳信息及變異規律。本研究用新開發的15對特異性SSR引物，對新疆野蘋果和栽培蘋果290份樣品進行遺傳多樣性和系統發育分析，揭示其遺傳變異規律和親緣關系，為新疆野蘋果的生態保育，蘋果優質新品種培育和產業的可持續健康發展等提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1試驗樣品

2016年至2017年對新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州鞏留縣和新源縣的新疆野蘋果健康狀況進行調查并采樣。根據新疆野蘋果樹上的枯枝率將新疆野蘋果按級別進行劃分[17]，共分6個級別，0級：單株枯枝率為0;Ⅰ級：單株枯枝率為0～10%;Ⅱ級：單株枯枝率為11%～40%;Ⅲ級：：單株枯枝率為41%～60%;Ⅳ級：單株的枯枝率為61%～90%;Ⅴ級：單株枯枝率為91%～100%。新疆維吾爾自治區伊犁州農業科學研究所基于前期調查研究篩選了一些疑似抗逆資源，本研究樣品于2017年9月采自新疆維吾爾自治區伊犁州農業科學研究所資源圃。栽培蘋果樣品于2017年7月至8月采自山東，樣品信息如表1所示。

1.2儀器和試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、SYBR Green I染料購自北京艾德萊生物技術有限公司，2×Taq Mix購自北京博邁德基因技術有限公司，Hi-Di去離子甲酰胺、POP-7 Polymer、GS-500LIZ相對分子質量內標購自美國ABI公司，A200型基因擴增儀購自杭州朗基科學儀器有限公司， DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠，超純水由 MILLI-Q 超純水純化系統制得，乙醇等其他化學試劑為國產分析純。

1.3DNA提取

取樣品葉片0.1 g，采用CTAB法提取新疆野蘋果和栽培蘋果的基因組總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20 ℃保存備用。

1.4PCR擴增

根據已報道的栽培蘋果品種金冠蘋果基因組[18]，獲得15對新疆野蘋果特異性SSR引物，如表2所示。DNA測序PCR反應體系25.0 μl：1.0 μl DNA模板，0.5 μl 上游/下游引物 （10 μmol/L）， 12.5 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase， 4.0 mmol/L MgCl2， 0.4 mmol/L dNTPs），最后用ddH2O補齊。PCR擴增條件是95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s， 52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環35次;72 ℃延伸10 min。PCR產物用SYBR Green I熒光染料染色在1% （質量體積比）的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。毛細管電泳PCR反應體系是30 μl，包括1 μl DNA模板、1 μl上游/下游引物（10 μmol/L，加熒光），15 μl 2×PCR Master Mix （包括 0.05 U/μl Taq DNA polymerase、4.0 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs），用ddH2O補齊。PCR反應條件為95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環35次;72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，取0.3 μl PCR產物用ABI 3730×l DNA analyzer進行毛細管電泳分析。

1.5數據處理

將上機結果原始文件導入Genemarker 2.2.0，按位點導出峰圖、Excel位點信息表。利用GeneMarker V2.2.0和POPGENE V1.32計算引物擴增的等位基因數、基因多樣性指數、多態性信息量;使用GenAlEx V6.501軟件計算各引物擴增的等位基因的PIC值;利用NTSYSpc V2.10e和MEGA V7.0軟件計算品種間的遺傳距離，用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀圖;根據遺傳多樣性系數（Na）、Neis基因多樣性指數、香農指數（I）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）進行遺傳多樣性分析。

2結果與分析

2.1遺傳多樣性參數和遺傳分化

用15對特異性SSR引物擴增290份不同地區、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品，對其遺傳多樣性和系統發育關系進行分析，共擴增出69個等位基因，平均每個位點擴增出4.6個等位基因，如表3所示。本研究結果表明，不同類群的等位基因數為1.40～3.67，有效等位基因數為0.98～2.28，Neis基因多樣性指數為0.20～0.46，香農指數為0.28～0.83，觀察雜合度為0.33～0.73，期望雜合度為0.25～0.76。根據這些遺傳多樣性參數評估可知，檢測的新疆野蘋果和栽培蘋果樣品遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數（Fst）為0～0.05時，一般認為遺傳分化低;Fst值為0.05～0.25時，一般認為中等程度遺傳分化;Fst值>0.25時，一般認為顯著遺傳分化[19]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群290份樣品的Fst為0.25，基因流（Nm）為0.76，由遺傳分化系數和基因流可知，不同類群間具有一定程度的分化，在總的遺傳變異中，種群間變異為24.86%。

2.2新疆野蘋果和栽培蘋果SSR位點特異性分析

15對特異性SSR引物在290份樣品中共擴出69個等位基因，平均每個位點擴增出4.6個等位基因。每個位點擴增的片段長度及等位基因數如表4所示。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴增的等位基因數最多，為10個;引物XS62-1-4擴增的等位基因數最少，為2個。特異性SSR位點分析結果表明，XS24-1-5-2（轉錄因子RAX3）位點獲得的等位基因是GL（V）、GL1、XY（V）特有的，由此可知編碼轉錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶。XS2-1-2（組氨酸激酶5）位點246等位基因是YN-red特有的。XS71-1-4（類TMV抗性蛋白質N端）位點440等位基因是GL（0）、GL1、GL2、XY-84特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質N端）位點367等位基因是YN-red特有的。XS71-1-5（類TMV抗性蛋白質N端）位點422等位基因是GL1、GL2、GL3特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶。XS63-1-10引物（擴增的基因序列編碼的蛋白質為類TMV抗性蛋白質N端）獲得的等位基因是山東煙臺栽培蘋果特有的[18]，XS25-1-8引物（轉錄因子bHLH74亞型X1）獲得的等位基因是LS、LY特有的，由此可知編碼類TMV抗性蛋白質N端、轉錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。

每個位點平均等位基因數，也稱為等位基因多樣性（通常用A表示）。GL（0）、GL（I）、GL（II）、GL（III）、GL（IV）、GL（V）、GL1、GL2、GL3、LS、LY、XY（I）、XY（II）、XY（III）、XY（IV）、XY（V）、XY-75、XY-76、XY-84、XY-89、XY-90、XY-91、YN-red見表1。

2.3新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群系統發育關系

由Neis無偏差異遺傳特征和遺傳距離可知，新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關系較近，新疆野蘋果內部具有較高相似性，栽培蘋果內部也具有較高相似性。基于Neis無偏差異遺傳距離構建的UPGMA進化樹可以將新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群或不同個體清晰、準確地分開，形成不同的進化分枝。由新疆野蘋果和栽培蘋果不同類群的UPGMA進化樹可知，栽培蘋果LY和LS類群與采自新疆伊犁農業科學研究所資源圃的紅肉蘋果聚于一類，采自鞏留、新源不同樣點、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果樣品聚于不同的分枝，但與采樣地點、癥狀級別等無明顯關系。鞏留、新源不同樣點、不同枯枝癥狀級別的新疆野蘋果樣品難以區分。由此可知，鞏留、新源兩地新疆野蘋果的親緣關系較近。基于新疆野蘋果和栽培蘋果不同個體的Neis無偏差異遺傳距離構建的UPGMA進化樹和遺傳距離結果表明，新疆野蘋果和栽培蘋果遺傳關系較近，但兩者可以準確分開，新疆野蘋果聚于一個大的進化分枝，栽培蘋果聚于另一個大的進化分枝，如圖1所示。

3討論

本研究發現新疆野蘋果和栽培蘋果親緣關系較近，新疆野蘋果種群遺傳多樣性豐富，不同類群間存在較高程度的分化水平，遺傳分化系數為0.25，基因流為0.76。研究結果與已有研究結果[20-21]基本一致。而揭示種群間遺傳分化水平的遺傳分化系數與所采用的分子標記和種群自身的遺傳變化有一定的關系[6，22]。新疆野蘋果和栽培蘋果不同種群間基因流相對較低，分化水平較為顯著。新疆新源和鞏留2個地區的新疆野蘋果聚于一個進化分枝，栽培蘋果與采自新疆的紅肉蘋果聚于一個進化分枝。關于新疆野蘋果遺傳多樣性的研究相對較多，但SSR標記大部分為非編碼區且功能未知，對于差異標記的功能作用等認知不足[6，21]。

通過特異性SSR引物，不僅可以揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統發育關系，而且對變異位點的抗逆特性也會有一定的了解。在不同SSR位點擴增的等位基因數有所不同，同一SSR位點不同等位基因在不同新疆野蘋果或栽培蘋果類群中出現的頻率也有所不同，如編碼轉錄因子RAX3的SSR位點在枯枝率大于90%的新疆野蘋果樣品中有特異條帶;編碼類TMV抗性蛋白質N端的SSR位點在新疆野蘋果中有特異性條帶;編碼類TMV抗性蛋白質N端、轉錄因子bHLH74的SSR位點在栽培蘋果中有特異性條帶。SSR引物XS71-1-4和XS72-1-1在290份樣品中擴增的等位基因數最多，為10;SSR引物XS62-1-4擴增的等位基因數最少，為2。不同新疆野蘋果或栽培蘋果種群具有不同的特異性SSR變異位點。這一現象可能與新疆野蘋果或栽培蘋果進化過程中對生境的適應性有一定的關系[1]。15對SSR特異性引物可以對新疆野蘋果和栽培蘋果進行遺傳多樣性、多態性或系統發育分析，揭示新疆野蘋果和栽培蘋果的遺傳多樣性和系統發育關系及獲得的遺傳變異對新疆野蘋果和栽培蘋果在生物學功能等方面的影響。通過這些新開發的SSR引物，可以很好地揭示新疆野蘋果和栽培蘋果之間的遺傳變異規律和系統發育關系，這些研究結果將為新疆野蘋果生態恢復、優質種源選育和優良栽培品種的創制提供一定的參考。新疆野蘋果在長期的進化過程中形成了許多抗寒、抗病蟲害等的優良性狀[23-24]。新疆野蘋果種內變異類型豐富，但缺乏系統遺傳多樣性的系統調查與評估，抗逆特性突出但基因資源深入挖掘與開發利用研究環節相對較為薄弱。目前新疆野蘋果無全基因組序列，對國內外新疆野蘋果起源、分化、擴散情況，以及新疆野蘋果抗病蟲害、抗寒和風味形成的遺傳構成、基因調控機制等研究有一定的影響，從而限制新疆野蘋果抗逆相關基因克隆和新型抗逆新疆野蘋果種質資源的創制[2]。全基因組關聯分析技術用于新疆野蘋果抗病蟲害基因的篩選，在全基因組范圍內找出存在的變異序列（SNP），以差異強表達候選基因為目標來開發多態性SNPs。該技術一次可定位多個性狀，而且定位精度高，可直接獲得與目標性狀相關的基因。因此，后續研究中有待于通過全基因組測序、轉錄組測序、全基因組關聯分析技術等對新疆野蘋果抗病蟲害（抗蘋果樹腐爛病和蘋小吉丁蟲）、抗寒以及風味形成的相關遺傳基因進行挖掘，分析其遺傳構成和基因調控機制。通過全基因組測序、轉錄組測序、全基因組關聯分析等技術，充分挖掘和利用新疆野蘋果基因資源，通過雜交育種與配套撫育等方法，創制營養價值高、經濟價值高的“功能性”新型蘋果品種，通過“利用保存”這一方式更好地保存新疆野蘋果遺傳資源，并基于優質的新疆野蘋果種質資源，解決中國栽培蘋果的遺傳背景狹窄、種質退化等相關問題，促進中國蘋果產業健康、可持續發展。

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（責任編輯：陳海霞）