參苓護肝膠囊定性鑒別和芍藥苷含量測定方法的研究

段立廣 王東晗 安緋悅 閆 凱*

（1、河北醫科大學第一醫院 藥學部，河北 石家莊050000 2、河北省藥品醫療器械檢驗研究院化學藥品檢驗室，河北 石家莊050000）

肝臟疾病誘發原因眾多，是一種常見的危害性極大的疾病。參苓護肝膠囊由白術、茯苓、白芍、赤芍等12 味藥材組成，膠囊內容物棕褐色、粉末、味苦，具有健脾益氣疏肝、保肝護肝的功效。參苓護肝膠囊作為河北醫科大學第一醫院的院內制劑，在探索中醫藥學治療慢性肝病方面取得了良好的臨床療效。經臨床觀察顯示，參苓護肝膠囊能降低谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST），并能有效防止慢性肝病再次復發的危險。查閱相關文獻，尚未發現有關參苓護肝膠囊的質量標準研究，本文建立了HPLC 法測定參苓護肝中芍藥苷含量的方法[1,2]，同時采用薄層色譜法對參苓護肝中白術、茯苓、白芍等成分進行了定性鑒別[3-5]，為參苓護肝膠囊質量標準的建立提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀（PDA 檢測器，美國Agilent 公司）；超聲波清洗儀（KQ-500KDE，昆山市超聲儀器有限公司）；自動點樣儀（Linomat-5，CAMAG 公司）；萬分之一電子天平（AE240，上海梅特勒儀器有限公司）；超純水制備機（Millipore 公司）；硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201438，純度＞98%）、白術對照藥材（批號：120925-200708）、茯苓對照藥材（批號：121117-200504）均購自中國食品藥品檢定研究院。三批參苓護肝膠囊樣品來自河北醫科大學第一醫院，黨參、白術、茯苓、柴胡、木香、厚樸、當歸、白芍、赤芍、法半夏、郁金、甘草經河北醫科大學第一醫院中藥室郭俊利中藥師鑒定。乙腈（色譜純），水（超純水），其它試劑（分析純）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 茯苓

稱取參苓護肝膠囊內容物5g，置于圓底燒瓶中，向其中加入乙醚30ml，加熱回流提取30min，濾過，將濾液蒸發至干，加入1ml 甲醇溶液將殘渣溶解，作為供試品溶液。另取茯苓對照藥材，同供試品制備方法制備，作為對照藥材溶液。按處方比例制成不含茯苓藥材的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備沒有茯苓的陰性對照溶液。依照薄層色譜法（通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液以及陰性對照溶液各10μl，點于同一硅膠G 薄層板上，將石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照24：5：1 的比例配置成為混合溶液并用作展開劑使用，預飽和30min，展開，展距15cm，取出，晾干，置于紫外光燈365nm 波長下進行檢視。如圖1 所示，在與對照藥材色譜相應的位置上，供試品色譜中顯示有相同顏色的熒光斑點，而陰性對照色譜中沒有此類熒光干擾。

2.1.2 白術

圖1 茯苓薄層色譜鑒別結果

取參苓護肝膠囊內容物5g，加正己烷30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1ml 正己烷溶液使溶解，作為供試品溶液。另取白術對照藥材，同法制備對照藥材溶液。按處方比例制成不含白術藥材的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制備缺白術的陰性對照溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性對照溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷- 異丙醇(50：1) 為展開劑，預飽和30min，展開，展距15cm，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照色譜無干擾，結果見圖2。

圖2 白術薄層色譜鑒別結果

2.1.3 白芍、赤芍

稱取參苓護肝膠囊內容物5g，加入30 ml 無水乙醇，使用超聲處理30min，濾過，采用水浴加熱的方法將濾液蒸干，用20ml 蒸餾水將殘渣溶解，每次使用15ml 的乙醚將其萃取，連續萃取3 次，萃取完成后棄去乙醚層；水層用15ml 水飽和的正丁醇連續萃取3 次，萃取后合并正丁醇層并將其水浴蒸干，用1ml的乙醇將殘渣溶解，將其作為供試品溶液。另外稱取芍藥苷對照品少許，加乙醇配制成1mg/mL 的對照品溶液。按照處方比例，稱取除白芍和赤芍外的其他藥材，制備沒有白芍和赤芍的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制成沒有白芍和赤芍的陰性對照溶液。按照薄層色譜法（通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各10μl，點于同一硅膠G 薄層板上。將氯仿、甲醇、甲酸按照20：5：1 的比例配置成為混合溶液并用作展開劑使用，預飽和30min，展開，展距15cm，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。如圖3所示，在與對照品色譜相應位置上，供試品色譜中顯示有相同顏色的斑點，而陰性對照色譜中沒有此類熒光干擾。

圖3 白芍、赤芍薄層色譜鑒別結果

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Accliam C18(5μm，4.6mm×250mm)；流動相：乙腈(A) -0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～7min，7%A→15%A；7～20min，15%A→30%A；檢測波長為230nm；流速：1.0ml·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10μl；理論板數按芍藥苷峰計大于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加適量甲醇溶解并稀釋成濃度為0.785 mg·ml-1的對照品儲備液。精密量取芍藥苷儲備液2.0ml 置于50ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備

取參苓護肝膠囊內容物0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，加入15ml 甲醇，超聲提取2 次，每次30min（功率400W，頻率40kHz)，合并上清液，水浴蒸干，殘渣用20ml 蒸餾水溶解，用乙醚萃取3次，每次15ml，棄去乙醚層；水層用水飽和的正丁醇萃取3 次，每次15ml；合并正丁醇層，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至25ml 容量瓶中，即得供試品溶液，備用。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例及制備工藝，將藥材粉碎后，制成缺白芍和赤芍的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 專屬性

取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖4。結果供試品色譜與對照品色譜色譜峰保留時間一致，陰性樣品相同保留時間無色譜峰，不干擾測定，且待測成分與其他物質分離良好。

圖4 供試品（A）、陰性樣品（B）、芍藥苷對照品（C）色譜圖

2.2.6 線性關系

取芍藥苷對照品適量，精密稱定，配置成系列濃度的對照品溶液，分別吸取10μl 注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得芍藥苷線性方程Y=138.7X-3.966，r=0.9999，線性范圍0.01816～2.797μg，結果表明芍藥苷標準曲線在線性范圍內有良好線性關系。

2.2.7 精密度試驗

取參苓護肝樣品0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，連續進樣6 次，芍藥苷峰面積RSD 為0.81%。結果表明，儀器具有良好的精密度。

2.2.8 穩定性試驗

取參苓護肝樣品0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，分別在0，3，6，9，12，15h 注入液相色譜儀，記錄峰面積。結果芍藥苷峰面積RSD 為1.19%，表明供試品溶液在室溫條件下15h 內穩定。

2.2.9 重復性試驗

取同一批參苓護肝膠囊樣品約0.25g、0.5g、0.75g 各三份，精密稱定，按“2.2.3”項下方法平行制備9 份供試品溶液，測定含量。計算得芍藥苷的平均含量為3.6102mg·g-1，RSD 為2.11%，結果表明，本實驗方法重復性良好。

2.2.10 回收率試驗

取已知含量同一參苓護肝樣品0.25g，共9 份，精密稱定，每三份為一組，分別精密加入低、中、高三個濃度的芍藥苷對照品溶液5ml，按“2.2.3”項下方法配制成回收率供試品溶液，依次進入液相色譜儀，測定回收率。芍藥苷的平均加樣回收率為101.47%，RSD 為2.52%，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n=9）

2.2.11 樣品含量測定

取3 批參苓護肝樣品各0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法平行配制供試品溶液各3 份，依照“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并用外標法計算樣品中芍藥苷的含量，結果見表2。

表2 參苓護肝樣品中芍藥苷含量（n=3）

3 討論

本實驗采用薄層色譜法對參苓護肝膠囊中茯苓[6]、白術[7-9]、白芍和赤芍[10-11]進行了定性鑒別。在茯苓薄層鑒別實驗時，比較了乙醚和乙醇不同提取溶液，超聲和加熱回流不同提取方法對色譜斑點情況的影響。研究發現，乙醚加熱回流提取法的薄層色譜斑點清晰，圓整。同時比較了石油醚- 乙酸乙酯(4：1)，石油醚- 丙酮- 乙酸乙酯(84：15：1)，石油醚- 乙醚(3：2)，石油醚-乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)不同展開劑對色譜分離情況的影響，發現石油醚- 乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)作為展開劑時，分離較好，無邊緣效應。

在HPLC 法測定芍藥苷含量的方法研究中[12-13]，對供試品提取液進行了乙醚和水飽和正丁醇的多次萃取操作，這樣大大降低了其他物質對芍藥苷色譜峰的干擾，使高效液相色譜基線更平穩。并比較了乙腈- 水，甲醇- 水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.1%冰乙酸水，乙腈-0.05%磷酸水等不同流動相梯度洗脫時峰的分離度和峰形，實驗發現乙腈-0.1%磷酸水為流動相時峰的分離度與峰形較好。

本研究建立了薄層色譜法對參苓護肝膠囊中白術[14]、茯苓、白芍、赤芍定性鑒別的方法和HPLC 法測定參苓護肝中芍藥苷含量的方法，建立的薄層色譜法分離度好，專屬性強，操作簡便快捷，高效液相色譜法精密度高，重復性好，結果準確可靠，本實驗為參苓護肝膠囊的質量控制和質量標準的建立提供了科學依據。