不同碳氮比對生物絮團形成及對日本沼蝦生長、抗氧化酶和消化酶的影響

金 毅 傅洪拓, 孫盛明 喬 慧 張文宜 金舒博 龔永生 蔣速飛 熊貽偉 錢 珺 張禹寧

(1. 南京農業大學無錫漁業學院, 無錫 214081; 2. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心,農業部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室, 無錫 214081)

隨著我國水產養殖業的不斷發展, 環境安全問題越來越嚴重, 不合理的排放和藥物的濫用加劇了對環境的污染[1—2]。生物絮團技術不僅能降低養殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽等無機氮含量[3], 還能促進養殖對象的生長[4], 提高餌料利用率和存活率[5—6]。碳氮比是指養殖水體中有機碳源和各種含氮物質質量的比值, 是影響生物絮團形成的重要因素。已有的研究表明, 水中的碳氮比達到15時就能產生絮團, 分泌胞外酶等活性物質, 促進異養微生物轉化吸收養殖水體中的無機氮[7—9]。目前, 生物絮團技術已經在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[10—11]、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)[12]、斑節對蝦(Penaeus monodon)[13]等蝦類養殖中得到應用, 但是生物絮團技術在日本沼蝦中的應用尚未見報道。

日本沼蝦(俗稱青蝦)隸屬長臂蝦科(Palaemonidae), 沼蝦屬(Macrobrachium), 是我國重要的淡水養殖蝦類之一, 因其肉質鮮美, 具有較高的經濟價值。根據2018年中國漁業統計年鑒顯示, 全國日本沼蝦年產量超過2.7×108kg[14]。鑒于碳氮比是生物絮團形成的重要因素[15], 因此本研究以日本沼蝦為研究對象, 研究不同碳氮比對生物絮團形成以及對日本沼蝦生長、腸道消化酶和肝胰腺抗氧化酶活性的影響, 為日本沼蝦的健康養殖提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗用蝦和飼養管理

實驗用蝦取自大浦養殖基地(119°55′23″E,31°18′47″N)。先將日本沼蝦暫養在室內的水缸中(30 cm×40 cm×100 cm, 120 L), 暫養1周穩定后, 將初始體重為(0.25±0.03) g健康且規格一致的日本沼蝦放入水缸中, 每缸50尾。養殖周期50d, 每天投喂兩次(9:00和15:00), 日投喂量為體重的5%—8%。對照組每天換水1/3, 實驗組實行封閉式零換水養殖, 因采集水樣和蒸發損失的水可以進行補充。養殖期間水溫25—28℃, pH7.4—8.4, 溶氧大于6 mg/L。每天對日本沼蝦的生長情況進行觀察和記錄。

1.2 碳源的選擇與添加

以葡萄糖為碳源[16], 實驗組按照不同碳氮比10(C/N10組)、15(C/N15組)、20(C/N組)和25(C/N25組)添加碳源, 對照組不添加碳源, 每組設置三個重復。按照Avnimelech[3]得出的生物絮團技術所需碳源計算公式根據確定各處理組添加葡萄糖的量分別是投喂飼料量的1/3、1/2、2/3和5/6。每次投喂1h以后, 取葡萄糖用養殖水充分溶解, 然后均勻潑灑。

1.3 樣品收集與分析

樣品收集在養殖過程中, 每7d取1次水樣, 立即帶回實驗室用于氨氮和亞硝酸鹽氮的測定; 在養殖實驗結束后, 禁食24h后取樣, 計數并稱重, 每個缸取5只日本沼蝦, 獲取完整的肝胰腺和腸道, 用液氮速凍后, 于–80℃冰箱保存。

酶活測定在肝胰腺和腸道解凍后, 稱取組織重量, 在冰浴條件下, 使用電動勻漿機勻漿, 按照1﹕9的比例把組織與生理鹽水混合制成濃度為10%的組織勻漿液, 溫度4℃, 轉速3000 r/min, 離心10min, 取出上清液用于相關酶活指標的測定。淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、谷胱甘肽還過氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的測定均使用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒, 酶活單位為酶量(U/mg)。

氨氮和亞硝酸氮的測定將水樣過濾后, 采用納氏試劑分光光度法測定水體中氨氮的濃度; 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定水體中亞硝酸氮濃度。

生物絮團測定采集水樣后均勻混合, 抽濾待測水樣, 濾膜烘干稱重測定總固體懸浮物(TSS)。另取1 L混合好的水樣倒入英霍夫錐形瓶中直至刻度線, 然后靜置30min, 待水樣中懸浮物完全沉淀后, 觀察沉淀物所在的刻度線, 此即為單位水體中生物絮團的體積[17], 記錄絮團體積。取出含有生物絮團的水樣在400倍顯微鏡下進行觀察。

生長指標測定

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=(Wt–W0)/W0×100;

特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=(LnWt–LnW0)/t×100。

存活率(Survival rate,SR, %)=Nt/N0×100

式中,Wt和W0分別表示日本沼蝦的終末平均重量和初始平均重量,t為養殖周期,N0和Nt分別表示日本沼蝦的終末存活尾數和初始放養尾數, 重量單位為克(g)。

1.4 數據統計和結果分析

各個指標測出的數據用SPSS19.0進行分析, 先進行單因素方差分析(ANOVA), 如差異顯著進行Duncan多重比較,P<0.5表示差異顯著, 數據結果以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。

2 結果

2.1 不同碳氮比對各組氨氮和亞硝酸鹽氮含量的影響

各組的氨氮和亞硝酸鹽含量在前4周呈升高趨勢, 在第4周達到高峰; 第4周以后對照組和C/N10組的氨氮和亞硝酸鹽含量持續升高而C/N15組、C/N20組和C/N25組呈下降趨勢(圖 1), 并逐漸保持穩定。其中C/N20組的氨氮和亞硝酸鹽含量在各個時期都保持在最低水平。

2.2 不同碳氮比對各組生物絮團形成的影響

在不同碳氮比條件下, 生成的生物絮團含量不同。養殖實驗初期, 由于絮團產生還不穩定, 各組含量在第2周有略微下降; 第3周開始, 生物絮團產生的量明顯上升, 隨后的4周保持穩定, C/N20組的生物絮團含量最高(圖 2)。

通過肉眼觀察水體以及對比濾紙發現, C/N20組的養殖水體呈棕褐色, 且顏色最深, C/N20組抽濾出的固體懸浮物最多(圖 3)。在400倍顯微鏡下觀察生物絮團可發現絲狀菌、小席藻、輪蟲、舟形藻、有機物和微囊藻等組成成分(圖 4)。

2.3 不同碳氮比對日本沼蝦幼蝦生長性能的影響

與對照組相比, C/N20組各項指標均是最高,C/N20組的末體重、增重率、特定生長率、存活率分別提高75.29%、88.86%、42.26%和36.68%(P<0.05, 表 1)。

2.4 不同碳氮比對日本沼蝦肝胰腺抗氧化酶的影響

C/N20組的日本沼蝦GPX活性為(37.10±1.36) U/mg與對照組和C/N10組差異顯著 (P<0.05), 分別高出了43.19%和40.80%。C/N20組與C/N15組和C/N25組差異不顯著(P>0.05, 圖 5)。C/N20組SOD活性最高為(36.25±2.84) U/mg與對照組、C/N10、C/N15、C/N25組差異顯著, 分別高出了73.35%、45.26%、28.17%和17.83% (P<0.05)。

圖 2 各組生物絮團體積(A)和總固體懸浮物(B)變化趨勢圖Fig. 2 The biofloc volume and total solid suspended matter in different groups

圖 3 顯微鏡下生物絮團形態圖Fig. 3 Biofloc pattern under microscope (×400)

2.5 不同碳氮比對日本沼蝦幼蝦腸道消化酶的影響

C/N20組日本沼蝦的淀粉酶活力最高為(1.56±0.02) U/mg, 與對照組、C/N10組、C/N15和C/N25組, 均有顯著差異, 分別高了231.91%、239.13%、97.47%和132.84%(P<0.05, 圖 6)。各組的脂肪酶活力相比均有顯著差異, 其中C/N20組的脂肪酶活力最高, 比對照組、C/N10組、C/N15和C/N25組分別高了25.45%、50.47%、20.45%和1.90%(P<0.05)。C/N20組的胰蛋白酶活性最高, 分別比對照組、C/N10組、C/N15和C/N25組高了36.45%、20.77%、19.15%和9.49%(P<0.05)。

3 討論

3.1 不同碳氮比對生物絮團形成和養殖水體的影響

生物絮團的形成主要靠水體中異養微生物的快速繁殖, 而微生物的生長繁殖最主要營養元素是碳和氮; 因此在本研究中, 按照不同碳氮比添加葡萄糖來培養生物絮團。由圖 2可知, 在C/N 20組中,養殖水體顏色呈棕褐色, 生物絮團形成的效果最好,生物絮團體積和總固體懸浮物均高于其他處理組。有研究表明, 碳氮比不同, 生物絮團產生的時間、效果和作用機制也不一樣, 因此維持適宜的碳氮比對生物絮團的產生至關重要。生物絮團可有效調節水質, 降低水體中三氮水平[18], 在實際生產中, 對水產經濟動物造成傷害的主要是氨氮和亞硝酸鹽, 在本研究中, C/N 15組和C/N 20組的氨氮和亞硝酸氮濃度顯著低于對照組和其他處理組。鄧吉朋等[13]的研究發現適宜的碳氮比能保證良好的水質, 但不同的是, 碳氮比越高水質越好。這與本研究中C/N 25組的結果有差異, 原因可能是物種和養殖過程上不同。

3.2 不同碳氮比形成的生物絮團對日本沼蝦生長的影響

圖 4 各組生物絮團總固體懸浮物Fig. 4 TSS of different groups

表 1 不同碳氮比對日本沼蝦幼蝦生長性能的影響Tab. 1 Effects of different carbon: nitrogen ratio on growth performance of Macrobrachium nipponense

圖 5 不同碳氮比對日本沼蝦幼蝦肝胰腺GPX(A)、SOD(B)的影響Fig. 5 Effects of different C/N ratio on activity of antioxidant enzymes in hepatopancreas of Macrobrachium nipponense

生物絮團是一種富含多種營養成分的絮狀物,其中含有35%—50%的粗蛋白和2.5%—9%的粗脂肪, 能量達到18—22 kJ/g[19], 能夠作為蝦類的潛在餌料。圖 1證明了生物絮團含有多種組成成分, 包括輪蟲和原生動物等, 其營養成分保證了日本沼蝦的生長。劉杜鵑等[12]在羅氏沼蝦(M. rosenbergii)育苗的實驗中, 證明了向養殖水體中添加碳源, 提高碳氮比有利于羅氏沼蝦仔蝦的生長, 提高出苗率。李京昊等[20]應用生物絮團技術養殖克氏原螯蝦(Procambarus clarkii), 碳氮比維持在15以上時,在減少投喂的情況下, 實驗組克氏原螯蝦的生長并沒有受到影響, 而在本研究中, 碳氮比的升高對日本沼蝦的生長有顯著影響, 在碳氮比20時, 生物絮團含量最多且該組的日本沼蝦的生長性能明顯高于其余各組。這表明生物絮團對日本沼蝦的生長起到了促進作用。這可能是因為產生的生物絮團含有的營養成分更易被日本沼蝦消化吸收, 也有可能生物絮團中存在某些具有促進生長的活性物質[21]。

3.3 不同碳氮比形成的生物絮團對日本沼蝦抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)在預防生物損傷, 減少自由基方面具有重要作用[22—23], 谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶, 是評價抗過氧化能力的重要指標之一。在本研究中C/N20組日本沼蝦的SOD顯著高于其他組(P<0.5)。這表明該組的日本沼蝦有更強的抗自由基能力, 保證了日本沼蝦的健康生長。這與生物絮團在克氏原螯蝦中的研究結果相似[20]。在本研究中, 從C/N15組開始, GPX有顯著提高; 這與凡納濱對蝦(L. vannamei)的研究結果相似[24]; 但區別在于,凡納濱對蝦(L. vannamei)的GPX在碳氮比15時活性最高, 而日本沼蝦的GPX在碳氮比20時活性最高,這或許是物種之間的差異造成的。也有報道認為,不僅是生物絮團中的微生物刺激了免疫機能的提升, 還有某些營養物質提高了機體的抗氧化水平,而碳氮比的高低影響了生物絮團的形成和其營養成分, 因此維持適宜的碳氮比對于提升養殖對象的抗氧化水平十分重要。在本研究中, 相比對照組,C/N20組的日本沼蝦SOD和GPX的顯著提高, 其具體作用機制還需進一步研究。

3.4 不同碳氮比形成的生物絮團對日本沼蝦消化酶活性的影響

圖 6 不同碳氮比對日本沼蝦幼蝦腸道淀粉酶(A)、脂肪酶(B)、胰蛋白酶(C)的影響Fig. 6 Effects of different C/N ratio on intestinal digestive enzyme activities of Macrobrachium nipponense

生物絮團能夠提升水生動物的消化能力。淀粉酶能水解糖原和淀粉, 有利于養殖動物對糖類營養物質的吸收。在本研究中, C/N20組的淀粉酶活性顯著高于其他組。這與Wang等[25]的研究結果相似。但葛海倫等[26]在羅氏沼蝦的研究中發現, 生物絮團并沒有提升羅氏沼蝦腸道淀粉酶的活性。可能是因為培養生物絮團的碳源不一樣, 導致絮團組成成分有所差異, 其發揮的作用也略有差別。脂肪酶能將甘油三脂水解, 促進腸道的吸收。在本研究中, C/N20組的脂肪酶顯著高于其他組, 證明了碳氮比20時, 生物絮團能夠顯著提高日本沼蝦腸道中的脂肪酶活性。徐武杰[24]的研究表明, 生物絮團顯著了提高了凡納濱對蝦(L. vannamei)的脂肪酶活性,促進了凡納濱對蝦對脂肪的消化吸收。在克氏原螯蝦[20]和羅氏沼蝦[26]的研究中, 均證明了生物絮團能顯著提升脂肪酶活性。胰蛋白酶是一種蛋白水解酶, 是評價蝦類生長和營養狀況的重要指標之一。在本研究中C/N20組的胰蛋白酶活性顯著升高, 這與凡納濱對蝦[24]、羅氏沼蝦[26]和克氏原螯蝦[20]的研究結果一致。

觀察發現, 日本沼蝦有攝食生物絮團的現象,而已有的研究表明生物絮團確實含有淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶等消化酶[27,28], 故推測日本沼蝦通過攝食生物絮團增加了腸道內的消化酶含量。消化酶含量的提高意味著機體消化能力和代謝水平的提高[29], 這有利于日本沼蝦的生長發育。然而,在碳氮比較低時產生的生物絮團較少, 甚至沒有生物絮團產生, 所以日本沼蝦無法攝食足夠的絮團提升消化水平。結合生物絮團形成規律并根據圖 2比較各組水體顏色和固體懸浮物含量并可知, C/N20組的生物絮團含量最多, 這與各組消化酶活性的變化規律以及日本沼蝦的生長規律相一致。因此, 適宜的碳氮比是形成絮團的重要條件, 也是促進日本沼蝦生長和提高消化酶活性的重要因素。

4 結論

本研究結果表明, 在日本沼蝦養殖過程中, 維持碳氮比20可有效形成生物絮團, 降低水體氨氮和亞硝酸鹽濃度, 提高日本沼蝦的生長指標、抗氧酶和消化酶活性。