球等鞭金藻對氟苯尼考脅迫的響應研究

張鶯臍 張羨宇 石 碩 劉佩武 張 倩 劉 鷹 郭 睿

(1. 大連海洋大學海洋科技與環境學院，大連 116023; 2. 設施漁業教育部重點實驗室，大連海洋大學，大連 116023)

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)是近些年來水產養殖業中使用最為廣泛的抗生素藥物之一, 因其可用于治療多種魚類的細菌性疾病, 如腸敗血癥、脊柱病、癤病和鏈球菌敗血癥等[1], 且具有抗菌活性高、無潛在致再生障礙性貧血等優點,作為氯霉素禁用后的主要替代藥物, 在水產養殖中發揮著重要作用[2]。據調查, 2013年我國抗菌藥物的總用量高達8.4×107kg, 其中氟苯尼考使用量將近1×107kg,列居所有獸用抗菌藥物用量的前列[3]。Zong等[4]在2007年對大連養殖場周邊海域的調查研究中發現,氟苯尼考殘留量達34.9—11000 μg/L。氟苯尼考理化性質穩定, 在生物體內不能被完全代謝[5], 經污水處理廠處理也不能被完全降解[3,6], 殘留的抗生素經多種途徑不斷的被匯入到水環境介質中, 造成了抗生素及抗生素降解物“假持久性”存在的現象[7],使得非靶標水生生物遭到長期慢性暴露。有研究表明, 水產養殖中常用的四種抗菌藥(多拉菌素、甲硝唑、氟苯尼考、土霉素)對水生態系統中的非靶標生物, 如海洋費氏弧菌(Vibrio fischer)、斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)、浮萍(Lemna minor)及水蚤(Daphnia)等均具有顯著的毒性作用[8]。

海洋微藻是海洋水生生態系統中的初級生產者, 可以通過光合作用為水體中軟體動物、甲殼動物和魚類等水生生物提供氧氣和食物, 其種類的多樣性及初級生產量直接影響整個水生系統的結構和功能[9,10]。球等鞭金藻(Isochrysis galbana)具有無細胞壁、體積小、繁殖快、營養豐富, 以及易被貝類幼蟲捕捉和消化吸收等特點, 常被用作海洋經濟雙殼類動物幼蟲優良的開口餌料[11]。此外, 球等鞭金藻細胞內富含多糖及多種重要的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)[12], 是類胡蘿卜素等活性物質的潛在來源[13], 也可作為化石燃料的生物替代品。同時, 球等鞭金藻易于培養,是進行水生生態毒理學研究的理想模式生物。

為探究水環境中抗生素殘留對非靶標生物的影響, 本文以球等鞭金藻為實驗對象, 研究環境相關濃度水平的氟苯尼考對球等鞭金藻生長和光合作用的影響, 并通過比較細胞內類胡蘿卜素和脂肪酸含量的變化探究氟苯尼考對球等鞭金藻細胞的急性毒性作用機理。本研究將探究對水產養殖環境中抗生素殘留的生態風險, 以期為水產養殖過程中抗生素的科學合理使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

球等鞭金藻藻種來自大連玉洋集團, 經擴增培養后作為試驗材料。氟苯尼考粉(純度為≥98%, 山東亞康藥業有限公司), 氟苯尼考標準品(CAS 73231-34-2, 純度≥99%)和乙酸銨(NH4Ac)購自Sigma-Aldrich, 色譜級甲醇和乙腈購自禹王集團。玻璃纖維過濾膜(GF/F, 47 mm)、固相萃取柱(Oasis MAX, 1 cc, 30 mg)購自Waters。實驗過程中所用器具在使用前, 于121℃滅菌鍋中高溫滅菌。

1.2 藻類培養及生長抑制

使用100 mL f/2培養基于錐形瓶中培養球等鞭金藻, f/2培養基主要包括: NaNO3、NaH2PO4、微量元素(ZnSO4·4H2O、MnCl2·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeC6H5O7·5H2O、Na2MoO4和Na2EDTA,純水配置)和維生素溶液[VB1、VB12和VH(生物素)]。培養基與滅菌海水按1﹕1000比例添加配置。

球等鞭金藻接種于150 mL錐形瓶, 培養體積為100 mL, 瓶口使用無菌透氣封口膜以防污染, 置于25℃光照培養箱中培養, 培養周期72h, 光照強度6500 lx, 光暗比12L﹕12D, 每天定時搖瓶3次。每天取出3 mL藻液, 使用分光光度計(GENESYS 10S,Thermo)于680 nm處檢測各實驗組培養液光密度,并以培養基作為參比確定藻液密度。利用血細胞計數板計數藻細胞生物量, 繪制生物量-光密度標準曲線(Y=14162X–0.0783,R2=0.999), 藻細胞生物量與光密度之間具有較好的相關性。實驗選取的氟苯尼考暴露濃度為0、0.001、0.01、0.1、1.0、10、20和50 mg/L, 其中包括已在養殖尾水中檢測到的殘留濃度(0.001 mg/L)[13], 及實際養殖過程中投喂濃度(10 mg/L), 每組設置三個平行。根據OD680計算抑制藻細胞生長的EC50值(半最大效應濃度)。

1.3 細胞內氟苯尼考含量的檢測

細胞中氟苯尼考濃度的檢測方法參照Song等[5]的研究, 使用高效液相色譜儀(HPLC, SPD-20A, 島津)檢測球等鞭金藻細胞內氟苯尼考的含量。

前處理方法: 利用玻璃纖維濾膜收集50 mL經氟苯尼考暴露72h的藻液(106cells/mL), 使用培養基沖洗濾膜后, 將濾膜置于15 mL離心管中, 加入5 mL色譜級甲醇, 渦旋2min, 超聲30min后, 利用細胞超聲破碎儀(800 w, 5min)進行細胞破碎。經4500 r/min離心10min, 收集上清液。重復上述步驟, 合并上清液。將上清液置于溫和的氮氣流下, 于40℃下濃縮液體至1 mL, 加入超純水至5 mL, 使用固相萃取柱進一步對樣品進行濃縮純化。固相萃取柱事先由4 mL 0.1%氨水甲醇、4 mL甲醇和4 mL超純水進行活化后過樣, 之后加入4 mL鉬酸銨(25 mmol/L,pH 4, 色譜級)進行淋洗, 使用1 mL甲醇和1 mL 0.1%氨水甲醇洗脫。取1 mL樣品裝入樣品瓶, 上機待測。甲醇和水、乙腈和水是檢測氟苯尼考時最為常用的流動相組合[14,15], 通過對流動相及流動相比例的改變, 發現當流動相為甲醇﹕水(v﹕v)=50﹕50時, 峰型較好, 適用于檢測球等鞭金藻細胞內氟苯尼考的濃度。

檢測條件: 流動相為甲醇﹕水= 50﹕50(v﹕v), 液相色譜柱采用Thermo Hypersil GOLD色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 柱溫40℃, 檢測波長為223 nm, 進樣流速為1 mL/min, 進樣量為20 μL。

標準曲線繪制: 稱取氟苯尼考標準品0.0010 g,使用甲醇(色譜級)溶解并定容至100 mL, 配制標準儲備液濃度為10 mg/L, 于–4℃冰箱中保存備用。上機檢測前使用甲醇稀釋成濃度為0.01、0.1、1、5、10 mg/L的標準溶液。HPLC檢測程序同上, 以峰面積為縱坐標, 氟苯尼考濃度為橫坐標, 繪制標準曲線, 并計算回歸方程及相關系數。

1.4 光合色素含量的測定

球等鞭金藻細胞中光合色素濃度的檢測方法參照Xiong等[16]的研究。不同濃度氟苯尼考暴露72h后, 收集10 mL藻液, 通過離心去上清(4500×g,10min, 4℃)獲得藻細胞團, 用于檢測藻細胞中葉綠素和類胡蘿卜素的含量。使用飽和碳酸鎂配置的90%丙酮溶液重懸細胞團, 以消除葉綠素酶干擾。在60℃黑暗條件下孵育30min后, 再次離心(4500×g,10min, 4℃)。取上清液于分光光度計在波長為665、652及470 nm處檢測吸光值, 并根據以下公式對光合色素的濃度進行計算:

1.5 脂肪酸含量檢測

藻粉的制備: 離心(4500 r/min, 5min)100 mL氟苯尼考暴露72h的藻液, 收集細胞團, 加入20 mL預冷的0.5 mol/L碳酸氫氨溶液去除藻細胞表面鹽分。再次離心(4500 r/min, 10min, 4℃)去上清, 收集藻細胞。使用冷凍干燥機(SCIENTZ-10N, 新芝)冷凍干燥24h, 恢復至室溫后, 使用瑪瑙研缽研磨, 制備藻粉。–20℃密封保存, 待用。

樣品前處理: 稱取藻粉4 mg, 加入30 μL十七烷酸甘油三酯(Glyceryl triheptadecanoate, CAS 2438-40-6, 3.04 mg/mL, Sigma), 加入5 mL 2%硫酸甲醇進行預處理。將樣品置于磁力攪拌器上, 在600 r/min、70℃下進行1h油浴, 對樣品進行甲酯化[17]。靜置, 待恢復至室溫, 加入0.75 mL超純水, 2 mL正己烷, 渦旋混勻后, 將樣品倒入裝有適量無水硫酸鈉的離心管中, 4500 r/min離心2min去除水分, 將上層有機相轉入1.5 mL進樣瓶, 上機檢測。

檢測條件: 使用氣相色譜儀(7890A GC System,Agilent Technologies, USA)對藻細胞內脂肪酸含量進行檢測。初始溫度為210℃, 進樣口的溫度為250℃, 檢測器的溫度為280℃。載氣為高純度N2和H2, 流速分別為20 和30 mL/min, 空氣流速為400 mL/min。自動進樣針清洗劑為正己烷, 進樣前后各清洗3次, 進樣量為1 μL。通過與標準脂肪酸保留時間進行對比, 鑒別各脂肪酸組分, 以面積歸一化法計算各脂肪酸組分的相對百分含量[18]。

1.6 數據統計

用SPSS18.0 統計軟件和Origin Pro軟件對測定結果進行統計分析, 實驗數據以平均值±標準誤(Mean±SE)表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行分析, 事后檢驗采用Duncan方法或Dunnett’s C test對各實驗組與對照組間的數據進行比較。當P<0.05時, 被認為具有顯著性差異, 當P<0.01時, 被認為具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 氟苯尼考對球等鞭金藻生長的影響

如圖 1所示, 當氟苯尼考濃度低于1 mg/L時, 對球等鞭金藻細胞的生長有一定的促進作用, 當濃度為10—50 mg/L時, 氟苯尼考對球等鞭金藻的生長產生了顯著的抑制作用, 且隨著氟苯尼考濃度的增加和暴露時間的延長, 抑制作用也明顯增加。20和50 mg/L氟苯尼考暴露組, 對球等鞭金藻存在顯著抑制作用(P<0.05), 抑制率分別為53%和83%。通過研究發現, 各濃度組(除50 mg/L濃度組)在暴露24h時, 對球等鞭金藻產生的抑制作用無明顯差異,隨著暴露時間的增加, 對球等鞭金藻生長的抑制作用逐漸增大, 72h時10、20 mg/L濃度組與對照組相比具有顯著的抑制作用(P<0.05)。

圖 1 氟苯尼考暴露對球等鞭金藻生長的影響Fig. 1 The effects of florfenicol on the growth of Isochrysis galbana at the different exposure duration

采用Origin Pro軟件非線性曲線擬合(NLFit)中的Growth/Sigmidal擬合工具對氟苯尼考暴露濃度和球等鞭金藻生長抑制率進行非線性擬合, 得到擬合模型的相關參數。擬合后效應曲線如圖 2所示, 計算得出, 氟苯尼考對球等鞭金藻72h-EC50為17.12 mg/L。

2.2 球等鞭金藻細胞內氟苯尼考的積累

根據優化的前處理方法和液相色譜分析條件進行分析, 氟苯尼考保留時間為4.2min, 如圖 3所示, 色譜峰與氟苯尼考濃度間具有良好的線性關系(Y=48844:2X?4796:54R2=0.99), 根據線性公式計算球等鞭金藻細胞內氟苯尼考的蓄積濃度。實驗結果發現, 在各濃度組暴露72h后, 藻細胞內氟苯尼考的積累量隨著暴露濃度的增加而增加, 在低濃度氟苯尼考(0.001、0.01和0.1 mg/L)暴露下, 并未檢測到細胞內氟苯尼考積累現象。在1、10、20、50 mg/L的氟苯尼考暴露72h后, 藻細胞內氟苯尼考積累濃度分別為5.2、11、65.4和122 μg/mL。

2.3 氟苯尼考對球等鞭金藻細胞內光合色素含量的影響

圖 2 氟苯尼考對球等鞭金藻生長抑制率的影響Fig. 2 The effects of florfenicol on the growth inhibition ratio of Isochrysis galbana

圖 3 球等鞭金藻中氟苯尼考的色譜圖Fig. 3 The chromatogram map of florfenicol in Isochrysis galbana

根據氟苯尼考暴露對球等鞭金藻生長的結果,選擇0、0.1、1、10和20 mg/L濃度作為后續試驗濃度, 其中包括EC50-72h值, 保持其他培養條件不變。如圖 4所示, 在氟苯尼考暴露72h后, 與對照組相比, 低濃度組(0.1、1 mg/L)中總葉綠素含量沒有顯著性差異, 10和20 mg/L濃度組總葉綠素含量分別顯著降低19%和22.5%(P<0.01)。藻細胞內類胡蘿卜素含量的變化趨勢則與葉綠素含量變化趨勢相反, 與對照組相比較, 1、10和20 mg/L暴露組細胞內類胡蘿卜素濃度均出現較為明顯的上升趨勢,1 mg/L濃度組中細胞內類胡蘿卜素含量極顯著增加13%(P<0.01), 而10和20 mg/L 氟苯尼考暴露組顯著增加26%和28%(P<0.05)。

2.4 氟苯尼考對球等鞭金藻細胞內脂肪酸含量的影響

圖 4 氟苯尼考暴露對球等鞭金藻細胞內葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig. 4 The effects of florfenicol on the chlorophyll and carotenoid of Isochrysis galbana

如表 1所示, 在試驗條件下, 暴露濃度對球等鞭金藻細胞內脂肪酸組成及含量具有明顯影響。在0.1和1 mg/L濃度組中藻細胞的總脂肪酸(Total Saturated Fatty Acids TFA)含量分別為(8.64±0.26)和(8.23±0.25) mg/mg, 與對照組相比呈顯著下降趨勢(P<0.05)。在10和20 mg/L濃度組中, 藻細胞脂肪酸含量分別為(9.23±0.53)和(9.46±0.21) mg/mg, 與對照組沒有顯著性差異。球等鞭金藻細胞內飽和脂肪酸(Saturated fatty acid SFA)及單不飽和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid MUFA)含量均無明顯的變化趨勢, 僅在暴露濃度為1 mg/L時, 存在明顯降低的現象。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids PUFA)是一類長鏈的多不飽和脂肪酸, 主要包括α-亞麻酸(C18﹕3, LNA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)[19]。相對于對照組, 1、10和20 mg/L濃度組的藻細胞中PUFA含量有明顯的增加趨勢,而DHA、EPA含量無明顯的變化。通過本研究發現, 在高濃度(20 mg/L)氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻細胞內的多不飽和脂肪酸含量均出現較為明顯增加的現象。

3 討論

3.1 氟苯尼考暴露對球等鞭金藻生長的影響

目前, 環境中抗生素殘留問題已經引起公眾的廣泛關注, 抗生素對微藻的急性毒性相關研究已取得了一定的進展, 但大部分研究集中于抗生素對淡水微藻的毒性作用的探究上[20—24], 而關于抗生素對于海水微藻的毒性作用機理的研究相對較少。氟苯尼考因其良好的藥效學特征和相對較低的毒性而大量應用于魚類細菌性疾病的治療中[25]。然而,抗生素在環境中的殘留會對非靶標生物產生不同程度的影響。Liu等[26]的研究發現, 氟苯尼考濃度低于2 mg/L時, 可促進中肋骨條藻(Skeletonema costatum)生長, 而濃度高于2 mg/L時, 氟苯尼考抑制其生長。然而, 在Ferreira等[27]的研究中發現, 土霉素和氟苯尼考對扁藻(Tetraselmis chuii)的抑制濃度分別為5.3和6 mg/L。本研究中, 50 mg/L濃度組在暴露24h時顯示出顯著的抑制現象, 隨著暴露時間延長不存在恢復現象, 10和20 mg/L濃度組在暴露48h后開始出現抑制現象, 10 mg/L組對球等鞭金藻生長的抑制作用低于20 mg/L組。本研究結果與Lai等[28]研究結果相似, 當氟苯尼考濃度大于10 mg/L時對球等鞭金藻的生長具有一定的抑制作用。在低濃度的抗生素的作用下對藻類的生長起到一定的生長促進作用[29], 當氟苯尼考暴露濃度小于等于1 mg/L對球等鞭金藻的生長有一定的促進作用。環境中低濃度抗生素持久性存在的現象, 可能會引起水體中浮游植物的大量生長, 如東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)和尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)等赤潮藻, 對生態環境產生一定的影響[30, 31]。

3.2 氟苯尼考暴露對球等鞭金藻細胞內光合色素合成的影響

光合作用是藻類重要的生理生化活動, 可將太陽能轉化為化學能, 葉綠素在光合作用和光合反應中起著重要的作用[32]。在環境脅迫下, 葉綠素含量的降低會影響細胞內光合反應中心捕獲光的能力,進而影響藻細胞內的光合活性。有研究表明[33], 水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)在氟苯尼考和甲砜霉素(> 1 μg/L)暴露1—7d后, 其葉綠素熒光參數Fv/Fm結果與葉綠素a含量的變化趨勢相似。本研究發現隨著氟苯尼考暴露濃度的不斷增加, 球等鞭金藻細胞內總葉綠素濃度呈下降趨勢, 當暴露濃度達到10 mg/L時, 出現顯著的抑制現象。造成該結果的原因可能有以下幾種: (1)藻細胞出現應激反應[34];(2)藻細胞中積累過量活性氧(ROS)導致葉綠體結構被破壞, 進而影響葉綠素的合成[26]; (3)在抗生素的脅迫作用下, 導致藻細胞類囊體脂質過氧化, 影響電子鏈的傳遞, 進而影響藻類光合效率[35]。光合作用作為衡量藻類生長狀態的主要指標[36], 通過比較本研究中藻類的生長與葉綠素含量的變化趨勢,提示氟苯尼考暴露可能會抑制球等鞭金藻的光合效率, 影響葉綠素合成, 進而影響球等鞭金藻的生長。

在環境脅迫下, 藻細胞損傷主要是通過氧化壓力形成的[37]。類胡蘿卜是細胞內主要的光保護色素, 可吸收葉綠體中剩余能量, 避免產生激發態的單一氧分子, 避免膜體損傷, 從而起到光保護作用[38]。本研究發現, 隨著氟苯尼考暴露濃度的增加, 球等鞭金藻細胞內的類胡蘿卜素含量逐漸增加, 這與其他研究結果相一致[39,40]。類胡蘿卜素根據其作用可分為初級類胡蘿卜素和次級類胡蘿卜素。初級類胡蘿卜素為補充色素, 與光合作用密切相關。而次生胡蘿卜素, 如蝦青素等, 是由某些微藻在高脅迫狀態時產生的, 不參與光合作用, 而是聚集在細胞脂質中, 抑制活性氧的生成, 進而保護葉綠體避免受損。此外, 類胡蘿卜素色素有高抗氧化的特性,可以保護微藻免受自由基攻擊, 穩定細胞代謝功能[41,42]。在低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)的作用下, 球等鞭金藻細胞內的類胡蘿卜素變化趨勢不明顯, 可能此時的類胡蘿卜素主要為初級類胡蘿卜素。而在高濃度氟苯尼考(>1 mg/L)的暴露下, 藻細胞受到抗生素的嚴重脅迫, 誘導藻細胞中次生胡蘿卜素生成, 起保護作用。由于藻細胞在高濃度氟苯尼考(20 mg/L)的暴露下會積累大量的活性氧, 可能會對藻細胞光合系統產生應激性損傷, 進而破壞細胞代謝功能, 紊亂其生長[43]。

表 1 不同濃度氟苯尼考暴露對球等鞭金藻脂肪酸(FAME)組成的影響Tab. 1 The effect of florfenicol on the fame composition in I. galbana (%)

3.3 球等鞭金藻細胞內脂肪酸含量對氟苯尼考暴露的響應

球等鞭金藻具有獨特的脂肪酸組成, 其富含營養價值較高的DHA和EPA, 是一種重要的水產養殖餌料生物[44]。有研究表明, 在蝦幼體、海水魚幼體及軟體動物幼體時期投喂球等鞭金藻, 可顯著提高水生物的生長和存活率[45]。通過本研究發現, 在氟苯尼考的暴露下, 球等鞭金藻細胞內DHA、EPA的含量無明顯的變化現象。但在0.1和1 mg/L濃度下,藻細胞內總脂肪酸含量較對照組有明顯下降的現象, 這可能與球等鞭金藻累積脂肪酸的特點有關,即生物量與總脂肪酸含量是呈極顯著性負相關的[46],當生物量升高時, 總脂肪酸含量呈下降趨勢, 此時細胞內的脂肪酸多用于細胞的生長分裂。暴露濃度高于1 mg/L時, 球等鞭金藻在抗生素的脅迫下,會將脂類作為首選的儲能化合物, 脂肪酸含量增加從而幫助細胞抵抗外界脅迫, 減少細胞死亡[47]。

氟苯尼考對球等鞭金藻的72h-EC50值為17.12 mg/L, 依據國家環保保護局的新化學物質危害評估準則—生態毒理學危害分級標準[48], 確定氟苯尼考對球等鞭金藻的危害等級為中級, 經過72h的氟苯尼考暴露, 球等鞭金藻生長、光合色素、脂肪酸等生理指標均受到影響。這表明在水產養殖過程中抗生素的使用, 可能會對非靶標生物產生一定的危害作用。隨著暴露濃度的增加, 抗生素在細胞內存在富集的現象, 這可能會導致水體中殘留的抗生素隨著食物鏈的傳遞而進入水生生物體內, 影響其生長發育。現有的研究多為抗生素對微藻類急性毒性實驗, 鮮少有環境中殘留的抗生素及其分解產物對水生動植物長期暴露的相關研究。因此, 有必要進一步探究環境中抗生素長期存在對水生生物的影響。

4 結論

本實驗以球等鞭金藻為實驗對象, 研究環境濃度氟苯尼考暴露72h后對球等鞭金藻生長的影響,探討氟苯尼考對海洋微藻的作用機理, 得到以下結論: (1) 氟苯尼考在低濃度時(≤1 mg/L)可以促進球等鞭金藻的生長, 而在高濃度(1 mg/L)時, 對球等鞭金藻表現出明顯的生長抑制作用, 氟苯尼考對球等鞭金藻72h-EC50值為17.12 mg/L, 符合中級毒性標準范圍。(2)氟苯尼考暴露(10 mg/L)會顯著降低球等鞭金藻的總葉綠素含量, 抑制葉綠素合成, 干擾球等鞭金藻正常的光合作用過程。(3)氟苯尼考暴露誘導球等鞭金藻細胞內類胡蘿卜素和脂肪酸參與抵抗脅迫損傷。