MicroRNA調控多不飽和脂肪酸合成關鍵酶研究進展

李 飆，馬海明*

（湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410000）

多不飽和脂肪酸（ployunsatura tedfatty acids, PUFA）是機體不可缺少的必需脂肪酸，而長鏈（≥C20）多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）具有PUFA的高度生物活性形式，其生物學功能以及與機體健康的關系一直是國際關注和研究的熱點。大量研究表明，PUFA更具體地說，n-3 LC-PUFA，如二十碳五烯酸（EPA；20∶5n-3）和二十二碳六烯酸（DHA；22∶6n-3）不僅參與信號傳遞和調節脂質代謝、炎癥反應和細胞分裂[1]以及相關基因表達等方面發揮重要作用，還能預防動脈粥樣硬化的形成和發展、預防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病，被稱為“血管清道夫”[2]。飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸可以被所有生物體生物合成，而PUFA通常必須在動物的飲食中獲得，盡管它們可以在某些物種中轉化為長鏈（C20-24） PUFA （LC-PUFA）。C18 PUFA利用有氧前端脂肪酸去飽和酶（Fads）和脂肪酸延長酶（ElovL）的途徑生成LC-PUFA[3]（如圖1）。該途徑中最不飽和的產物DHA和22∶5n-6的底物分別為18∶3n-3和18∶2n-6。所涉及的酶對n-3和n-6系列脂肪酸均有作用，一般都偏愛n-3。以n-3例，EPA的生成需要Δ6去飽和酶和Δ5去飽和酶分別從α-亞麻酸（ALA;18∶3n-3）去飽和生成18∶4n-3，從20∶4n-3去飽和生成EPA[4]；另一個途徑是ALA延長生成20∶3n-3 后緊接著通過Δ8和Δ5去飽和酶去飽和作用生成EPA[5，6]。在某些魚類，可以直接通過EPA延伸產物22∶5n-3利用Δ4去飽和酶生產DHA[7]。但在哺乳動物中，從EPA到DHA似乎涉及到一個更復雜的路徑，該途徑是脊椎動物中最普遍的DHA生物合成途徑——“Sprecher通路”，EPA需要連續兩個碳鏈延長產生24∶5n-3，然后通過△6-脫氫酶的去飽和作用生成24∶6n-3，最后通過過氧化物酶催化脂肪酸的β-氧化縮短碳鏈生成二十二碳的DHA[8]。另一種是“Δ4去飽和酶通路”，△4 途徑一般發生在低等生物中，是 EPA 轉化為 DHA 的主要途徑，然而Hui Gyu Park等人[9]在細胞中證實，二十二碳五烯酸（DPA ，22∶5n-3）和 腎上腺 酸（ADA，22∶4n-6）直接通過FADS2基因產物通過△4脫氫形成不飽和鍵，分別生成 DHA，這為探究FADS2基因功能提供一條新思路。然而兩種途徑都首先需要乙酰輔酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase,ACC）和脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）兩種胞質酶進行合成，然后在脂肪酰基去飽和酶（Fads）和超長鏈脂肪酸（ElovL）蛋白的兩組酶的協同作用下對脂肪酸進一步延長和去飽和，從而獲得碳鏈較長的不飽和脂肪酸[10]。

MicroRNA（miRNA） 是 一類內源的、進化保守的小非編碼RNA，其長度約為22個核苷酸（nt）。具有典型的發夾環結構，在真核生物的基因組上，最初RNA聚合酶II從基因間區域或重疊基因（蛋白質編碼或非編碼）中編碼的初級轉錄本轉錄為初級miRNA（pri-miRNA）。然后裂解核酸內切酶Drosha，在細胞核內形成前體miRNA（pre-miRNAs， 約 70 nt）。然后，前miRNA被另一種內切酶Dicer處理，在細胞質中產生22 nt長度的具有功能的 miRNA成熟體。與長鏈非編碼RNA、環狀非編碼RNA和 pi RNA等其他非編碼RNA相比，mi RNA的調控機制相對簡單。通常，成熟的miRNA通過其“種子區”（miRNA的5'端的2～8個核酸序列）能夠與靶基因的3'非翻譯區（3' UTR）部分或完全互補結合，使mRNA不穩定，翻譯延遲或抑制目標基因的表達[11]。在哺乳動物物種中，據估計只有1%～5%的基因組轉錄本編碼miRNA，但是多達60%的基因直接或間接受miRNA調控。目前在動物上發現和確認的 miRNA 在不斷增多。有人提出一種miRNA可以調節數百種mRNA的表達，而一種mRNA的表達又可以同時被數百種miRNA調節。換句話說，miRNA可以通過在生物體中構建復雜的調控系統，憑借對大量靶基因的調控，miRNA 參與機體內的多種生命活動，除了細胞的增殖、分化、死亡、應激反應、胞內代謝和信號傳導[12，13]。同時越來越多的研究表明，miRNA在脂質代謝中起著重要的調控作用。例如，在哺乳動物肝臟中大量表達的miR-122可以特異性通過靶向陽離子氨基酸轉運蛋白1（Cpt1α）的調節來調節肝臟蛋白質的代謝；同時還可以通過抑制參與膽固醇生物合成的基因的表達來調節肝臟脂肪酸和膽固醇的合成[14]。此外，miR-33a/b靶向參與脂肪酸氧化調節的關鍵酶，包括肉堿O-辛基轉移酶，肉堿棕櫚酰轉移酶1A，羥酰基-CoA-脫氫酶，Sirtuin 6（SIRT6）和AMP激酶亞基-α，并協同調節膽固醇穩態；miR-33a/b也靶向胰島素受體底物2，這是肝臟中胰島素信號通路的重要組成部分[15]；miR-27a/b通過靶向PPARγ抑制脂肪細胞分化和甘油三酸酯的積累，參與肥胖中的脂肪組織失調，表明脂質代謝相關基因轉錄后沉默調控的另一重要元素需要依賴 miRNA[16，17]。

無論無脊椎動物還是豬、牛等脊椎動物，都擁有編碼LC-PUFA生物合成途徑中涉及的去飽和酶和延長酶的基因，盡管其確切的功能和受到非編碼RNA調控功能仍有待闡明。

1 miRNA對PUFA合成途徑關鍵去飽和酶的調控與機制

生物血液和組織PUFA濃度由膳食攝入和內源性合成共同決定，通過膳食前體亞油酸（18:2n-6,LA）和a-亞麻酸（18:3n-3, ALA）的連續伸長和去飽和。Δ5去飽和酶和Δ6去飽和酶參與了這一酶過程，分別由兩個同源直系基因FADS1和FADS2基 因 編 碼。FADS1和FADS2基因與FADS3基因位于染色體11q12-q13.1上的一個簇中。該基因簇由92 kb組成，頭對頭方向為FADS1和FADS2，尾對尾方向為FADS2和FADS3。FADS1和FADS2的內含子1被一個11.4 kb的區域隔開，FADS3位于FADS2的6.0 kb端 粒 側[18]（ 如 圖2）。FADS3的生物學功能尚不清楚。

肝臟是參與PUFA生物合成的主要器官，也是FADS1和FADS2表達的主要部位[19]。Li等[20]在研究20周齡和30周齡母雞的肝臟microRNA表達差異中，首次發現FADS1被 miR-365-3p，miR-218-5p，miR-181a-5p，miR-181b-5p，miR-29a-3p和miR-23b-3p靶向，而FADS2被miR-30c-1-3p靶向。這項研究為miRNA在脂質代謝分子調控系統中的詳細功能提供了基礎資源。Zhang等[21]通過雙熒光素酶報告證明了，mir - 17在河豚原代肝細胞（Schl）中直接靶標Δ4 FAD的3'UTR，影響了FAD1和FADS2的表達，參與了LC-PUFA生物合成的調控。除了直接靶向以外，還有間接調控FADS上游基因。他還發現miR-33在Schl中靶向胰島素誘導的基因1（insig1），阻斷了LC-PUFA生物合成的激活因子甾醇調節元件結合蛋白-1（Sembp 1）的蛋白水解激活，從而抑制LC-PUFA生物合成的關鍵酶Δ4、Δ6、Δ5脂酰去飽和酶（FADs）的表達[22]。除此之外，Chen等也發現通過 Insig1/Srebp1 通路軸調控LC-PUFA生物合成的還有miR-24[23]。

在豬等脊椎動物中，無論是胚胎時期，還是出生后及成年，每個生命時期的肝代謝程序轉換是一個復雜的分子調控系統。例如，剛孵出的小雞在孵化后這些卵黃脂質會迅速消耗殆盡，新陳代謝轉化為由碳水化合物為基礎的能量來源，由于消化系統發育不良，不能像成年雞那樣有效地利用飼料[24]；通過采用延遲喂養48 h來阻止肝臟代謝轉換，發現延遲喂養導致miR-20b表達增加，而其靶標FADS1的表達相反地減少；表明在轉錄前后，FADS1基因受到miRNA介導，參與了這一轉換[25]。同時miR-33的表達顯著降低，miR-33是脊椎動物中著名的脂質代謝調節劑，已有報道在雞中被證明具有抑制肝臟脂肪酸氧化的作用[26]，此結果進一步支持了miR-33在調節肝臟脂質代謝中的作用，表明它是雞代謝開關的重要轉錄后調節因子。提示在肝代謝轉換時期，脂肪酸的從頭合成可以幾乎被抑制，這可能由于SREBF1及其下游FADS的表達減少所致，而miRNAs在這種代謝轉換過程中是肝臟代謝通路的關鍵調控因子。

2 miRNA對PUFA合成途徑關鍵延長酶的調控與機制

脂肪酸延長酶（elongase of very long chain fattyacids, ELOVL）是位于內質網上的膜結合蛋白酶，主要參與延長循環反應中的第一個縮合反應[10]。哺乳動物中發現的延長酶家族種類最多，含有7個成員，分別為 ELOVL1~ELOVL7，其對不同的脂肪酸底物表現出不同的底物特異性。ELOVL1、ELOVL3、ELOVL6和 ELOVL7 主要延長飽和以及單不飽和脂肪酸，但不參與長鏈PUFA的伸長[27]；而ELOVL2、ELOVL4 和 ELOVL5 與魚類全長cDNA序列具有高度同源性，功能也具有相似性，主要催化多不飽和脂肪酸的延長反應中C18和C20 PUFA 底物的碳鏈延伸[3，28，29]。

2.1 ELOVL2

ELOVL2是長鏈多不飽和脂肪酸合成中的關鍵延長酶，其主要參與DHA前兩步合成過程，即由EPA轉化為二十二碳五烯酸（DPA,22∶5n-3），以及進一步延長為24∶5n-3。然而，小鼠的ELOVL2能夠在一定程度上可延長18∶3n-6，而人類的ELOVL2則不能，這表明不同物種之間可能存在一些功能差異[3]。在人原發性肝細胞（PHHs）去分化的研究中，發現了ELOVL2在去分化PHHs中下調，這與超長鏈PUFA濃度降低一致；此外，還發現在去分化過程中出現多種miRNA差異表達，提示在PHHs去分化過程中miRNA通過調控ELOVL表達參與PHH脂質的合成、積累和分泌[30]。

2.2 ELOVL5

ELOVL2和ELOVL5酶在哺乳動物的大多數組織中普遍表達。盡管ELOVL5在大鼠中可能存在物種差異，在肺和大腦中表達最高，而人類的ELOVL5在睪丸和腎上腺中表達尤其高，其特征為22∶5n-6水平相對較高[31，32]。這兩個延長酶具有重疊的生理功能，ELOVL5能夠延長C18和C20 PUFA，但對C22沒有活性，而ELOVL2能夠延長C20和C22 PUFA，但ELOVL2和ELOVL5對飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸都沒有活性[4，33]。

許多研究證明ELOVL5對C18和C20為底物的脂肪酸的轉化活性具有重要性[10]。Chen等首次發現miR-146a可能通過靶向ELOVL5參與調控SCHL細胞LC-PUFA生物合成，并發現miR-146a過表達顯著降低了依賴于ELOVL5的PUFA延長指數，如20∶3n-6/18∶3n-6、20∶4n-3/18∶4n-3、22∶5n-3/20∶5n-3，從而降低了SCHL細胞的LC-PUFA含量[34]。

已有文章報道ELOVL5通過參與控制脂肪細胞甘油三酯脂肪酶（也稱為蛋白樣磷脂酶結構域，patatin-like phospholipase domain）的豐度，從而調節甘油三酯（TG）水平來調節脂質代謝[35]；而在此脂質代謝調節過程中miRNA 可能發揮了正向調控作用。Li等[36]通過生物信息學分析預測出ELOVL5是miR-21-3p的靶基因，隨后實驗中被證實，在乳腺上皮細胞（MECs）中表達bta-miR-21-3p促進了甘油三酯的產生，這可能與靶基因ELOVL5的調控有關。除此之外， Zhang等[37]在雌性激素處理的產蛋期雞的原發性肝細胞中發現6個miRNA顯著下調，并且證實miR-218-5p可以直接靶向ELOVL5，發現雌激素可以上調ELOVL5的表達，間接促進產蛋母雞肝臟中LCPUFA的合成，而此調控可能依賴與miRNAs。綜上所述，ELOVL5可被多個miRNA直接調控影響LCPUFA的合成，同時ELOVL5也可以受到其他因子保護不受miRNA介導的影響，這也間接說明了 ELOVL5在脂肪及碳水化合物的代謝的重要性[38]。

2.3 ELOVL6

ELOVL6 的主要功能是催化單不飽和脂肪酸的合成，比如催化C16 脂肪酸延伸為 C18；其主要在肝臟、脂肪組織和腎上腺等脂質含量較高的組織或器官中表達較高[3]。ELOVL6 基因是影響脂肪酸合成的關鍵基因，是將棕櫚酸轉化成進一步延伸成硬脂酸的限速酶；除此之外，ELOVL6還是參與維持機體脂肪酸代謝平衡的關鍵因子，在最新的研究中發現ELOVL6與胰島素抵抗[39]，非酒精性脂肪肝[40]和肝炎動脈粥樣硬化[41]等發病機理有關聯。深入研究ELOVL6基因有助于了解肝臟中脂肪酸的組成變化機制。

已有報道ELOVL6在過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和脂肪酸代謝信號通路中發揮關鍵作用[42]。ELOVL6 不僅可以直接調控機體的代謝作用，還可以在其他基因調控中發揮作用。在Hep G2細胞中碳水化合物反應元件結合蛋白（carbohydrate response element binding protein, ChREBP）和固醇調節元件結合蛋白-1C （sterol regulatory elementbinding protein-1C, SREBP-1C）的異位共表達可以協同刺激ELOVL6啟動子；Moon 等[33]人研究發現ELOVL6 的表達還可以同時受到 SREBP-1和肝X受體α（LXRα）的直接調控，但SREBP-1a對ELOVL6的誘導作用更顯著[43]。此外，ELOVL6在不同動物組織中還可 以 被 miR-22-3P[44]、mir-144[45]、miRNA-125a-5p[46]等多種miRNA直接調控；當ELOVL6表達被抑制時，棕櫚酸（C16∶0）含量顯著增加，而油酸（C18∶1，n-9），二十碳烯酸（C20∶1，n-9）和二十碳三烯酸（C20∶3）含量顯著降低，表明miRNAs可以影響ELOVL6的表達來調節一些細胞中飽和脂肪酸和長鏈不飽和脂肪酸的含量。不僅如此，在脂肪細胞的生長發育研究中，證實了ELOVL6為miR-204的直接靶基因，參與調控脂肪細胞的成脂分化，猜測ELOVL6可能是mir-204與脂肪分化直接調節因子之間的中間調節因子[47]。

3 miRNA對硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）的調控與機制

單不飽和脂肪酸是合成PUFA的底物。硬脂酰輔酶A去飽和酶（S tearoyl-CoA desaturease , SCD ）也稱為Δ9去飽和酶，是肝細胞催化飽和脂肪酸 （saturated fatty acid, SFA） C9脫氫形成 n-9 系單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFA）的關鍵限速酶，分別轉化生成油酸 （OA，C18∶1）與棕櫚油酸 （PA，C16∶1）。多不飽和脂肪酸（PUFA）不僅是體內能量的重要來源，而且是生物膜的重要組成成分。而這兩種物質是合成膜磷脂和中性脂（包括甘油三酯和膽固醇酯等）的重要底物[48]。故SCD基因的表達或者酶活性的改變將會影響細胞內飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例，進而影響膜磷脂的組成，這對維持細胞膜的流動性及信號傳遞等很重要[49，50]。

有文章指出SCD表達變化與硬脂酸和油酸的比例改變直接相關，這將會影響生物膜的流動性以及信號轉導過程，進一步影響細胞的生長與分化[51]。除了已報道的共軛亞油酸、乙醇、類固醇激素等多種外源因素會影響肝臟SCD的活性外，許多內源因子也會改變SCD 的功能表達[52]。Tan等[53]研究發現miR-199a-3p可以直接靶向調控硬脂酰輔酶a去飽和酶（SCD）的表達，從而抑制了3T3-L1脂肪細胞的脂質積累，并參與脂質轉錄、脂肪酸合成，尤其影響脂肪酸轉運的脂肪細胞特異性基因的表達顯著下降，而脂肪酸氧化過程得到了增強。SCD被直接靶向調控還有miR-125b[54]、miR-192[55]、miR-29a[56]，均參與脂滴積累和MUFA的組成。除此之外，SCD還可以和脂肪酸合成酶（FAS）共同 被 miR-212-5p[57]、miR-27a[58]直接靶向，影響肝細胞甘油三酯（TG）的積累。

4 小結

長鏈（≥C20）多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）具有PUFA的高度生物活性形式，在人類和其他動物的生理生化過程中發揮著重要作用。然而，在過去的十年中，大量的外源因子和內源轉錄因子被證明可以控制數百個與脂代謝相關的基因。其中，miRNA作為轉錄后調控因子參與脂質代謝調控也受到人們越來越多的關注。筆者發現上述幾種LC-PUFA合成關鍵限速酶在不同物種不同組織中可以被多個miRNA調控，即使在同一細胞中也存在這種情況，說明可能存在其他內源調控因子，但相關研究少之又少；并且大量研究集中于一種miRNA驗證工作，無法真實反應miRNA在脂質調控，尤其在不飽和脂肪酸合成代謝動態調控中的情況。

隨著研究技術不斷提高，將會有更多涉及PUFA合成的 miRNA 將被發現和確認。已有大量報道中國地方品種豬肉質好于瘦肉型豬種，究其原因中國地方豬種肌肉和脂肪中含有大量不飽和脂肪酸等風味物質。例如朱吉等對寧鄉豬肉質研究發現其肌肉中肌內脂肪高達5.37%，且 油 酸（18∶ 1）51.0%， 亞 油酸（18∶2）7.74%，飽和脂肪酸59.6%，遠高于瘦肉品種，表明寧鄉豬種質優良、可塑性強[59]。研究中國地方豬肝臟、脂肪、肌肉組織中miRNA 的表達、功能以及其對PUFA合成關鍵酶的調控作用能夠深入揭示長鏈多不飽和脂肪酸合成及代謝的分子調控機制。這些研究工作一方面有助于開發脂代謝紊亂相關疾病的檢測標志物和靶向診療藥物，另一方面有助于通過遺傳改良針對性地培育富含DHA、EPA等n-3 LC-PUFA的畜禽動物。不僅如此，隨著高通量測序技術不斷發展，深度挖掘LncRNA和CircRNA作為miRNA內源競爭RNA參與PUFA合成及代謝調控也將成為今后研究熱點。