宮頸低級別鱗狀上皮內病變進展的預測因素

房園園，謝滿鑫，邢燕

(南京醫科大學第一附屬醫院婦產科，南京 210029)

宮頸癌是我國常見的婦科惡性腫瘤之一，隨著人們對宮頸癌認知的不斷提高及宮頸癌篩查的普及，宮頸癌前病變的早期發現和早期干預使得宮頸癌的發病率及死亡率逐漸下降。宮頸鱗狀上皮內病變(squamous intraepithelial lesion，SIL)是與宮頸癌發病密切相關的一組宮頸病變,既往被稱為宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。WHO女性生殖器腫瘤分類(2014)[1]建議將子宮頸上皮內瘤變三級分類法(CIN1、CIN2、CIN3)更新為與細胞學分類相同的二級分類法，即低級別鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)和高級別鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)。LSIL相當于CIN1及部分CIN2，HSIL包括CIN3和大部分的CIN2。指南建議用p16免疫組織化學法對CIN2進行分流，p16陰性者按LSIL處理，采用隨訪的方式即可，而p16陽性者則按HSIL處理，需要治療。LSIL患者中有60%會出現病變的消退，30%出現病變的持續，而10%出現病變的進展[2]。近年來，宮頸病變發病人群呈年輕化趨勢，部分患者為有生育要求的育齡期女性，若采取手術治療可能會導致早產、流產、宮頸功能不全等不良預后結局，因此識別LSIL進展的高危人群并避免對非進展型或消退型LSIL患者的過度治療，實現對LSIL患者進行分類管理尤為重要?，F就LSIL進展的相關預測因素予以綜述。

1 人乳頭瘤病毒因素

SIL好發于宮頸轉化區，其發病通常被認為與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持續感染密切相關[3]。HPV是雙鏈環狀DNA病毒，其基因組包含非轉錄、早期轉錄、晚期轉錄3個功能區域。由早期轉錄編碼的早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7等)在HPV復制、轉錄、翻譯等過程中發揮重要作用,其中E6與E7是HPV最主要的致癌蛋白，E6和E7分別通過使抑癌蛋白p53和Rb失活而致癌。晚期轉錄區則負責編碼病毒衣殼蛋白L1、L2。HPV感染的生命周期包括兩個階段：第一階段是病毒建立感染的游離階段。在這一階段，HPV感染基底細胞，L1和L2包住病毒基因組并在細胞核內形成子代病毒，之后子代病毒釋放，重新引發新的感染。因此，病毒的游離階段是指L1衣殼蛋白表達的早期階段。第二階段是病毒的整合階段，在此階段，HPV DNA整合到宿主DNA中，HPV E6和E7癌蛋白作用于宿主調節蛋白從而導致許多蛋白的表達發生改變，其結果是p53抑癌基因和Rb通路的降解，從而抑制細胞的分化、凋亡和免疫應答，導致HSIL的發生、遺傳和表觀遺傳的改變進一步使病變發展為侵襲性腫瘤[4-5]。目前對高危型HPV(high-risk human papilloma virus,HR-HPV)的載量及分型的檢測應用廣泛，HPV DNA甲基化的檢測方法逐漸成熟，這些均為預測LSIL病變的進展提供了新思路、新方法。

1.1HPV分型及載量 宮頸癌前病變及癌變相關的HPV亞型可以分為低危型HPV和HR-HPV兩大類，低危型HPV主要包括HPV6、11、30、42、43、44、61等，HR-HPV主要包括HPV16、18、26、31、33、35、52、56、58等。大量的國內外研究表明，LSIL的進展與HR-HPV的持續感染密切相關[6-9]。國內一項對621例宮頸病變患者進行的回顧性研究發現，隨著病變程度的加重，HPV陽性患者比例增加,HPV陽性患者中檢出率最高的5種基因型分別為HPV16、52、58、68和18，其中低級別病變組中檢出率較高的基因型為HPV16、52、68、53和58，且隨著病變程度的加重HPV16的檢出率明顯增高[6]。Choi等[7]研究表明，44例HPV16陽性的LSIL患者中病變消退率為38.6%，持續或進展率為61.4%，而57例非HPV16感染的LSIL患者中病變消退率為77.2%，持續或進展率為22.8%。Liu等[8]進行的Meta分析表明，HPV陽性組中CIN1患者出現進展、持續及消退的風險分別為HPV陰性組的3.04倍、1.48倍、0.65倍；持續HR-HPV感染組的CIN1病變進展風險和消退風險分別為陰性組的13.91倍、0.61倍，而短暫性HR-HPV感染對CIN1病變進展及消退的風險與陰性組相比差異無統計學意義。由此可見，HPV的持續感染，特別是HR-HPV感染與LSIL的進展密切相關。Mittal等[3]進行的前瞻性研究表明，CIN的進展除與年齡增加、持續性病毒感染有關外，病毒載量增加也是CIN進展的一項獨立風險因素。Wang等[9]對1 590例經組織學確診為LSIL或正常組織的患者進行6年隨訪發現，由LSIL進展為HSIL的累積發病率隨基線HPV載量的增加而增加。因此，LSIL的進展與HR-HPV的持續感染(特別是HPV16的感染)及病毒載量的增加密切相關，臨床上應注意對具備該類危險因素的患者進行密切隨訪。

1.2HPV L1 HPV結構域的基因編碼了病毒衣殼蛋白，HPV L1衣殼蛋白占病毒表面全部衣殼蛋白的90%。HPV L1衣殼蛋白只在HPV復制的早期階段產生，其存在可以反映HPV在細胞內復制的狀態，常表明HPV的一過性感染。Hu等[10]對1 222例宮頸病變患者進行回顧性研究發現，在正常宮頸組織或宮頸炎、LSIL、HSIL、宮頸癌患者中，HPV L1陰性表達率分別為91.2%、40%、81.2%、100%，LSIL、HSIL和宮頸癌患者HPV L1的陰性表達率比較差異有統計學意義，隨著宮頸病變程度的增加，HPV L1蛋白表達下調。Cao等[11]對50例宮頸活檢病理為LSIL的患者進行回顧性研究表明，HPV L1陽性LSIL患者病變的非進展率高于HPV-L1陰性LSIL患者，病變進展與HPV-L1的表達呈負相關，而與細胞角蛋白7(cytokeratin 7，CK7)表達呈正相關。在聯合評價CK7和HPV L1時，CK7陽性/HPV L1陰性組與CK7陰性/HPV L1陽性組的非進展率比較差異有統計學意義，提示CK7陰性/HPV L1陽性與LSIL病變的非進展密切相關，CK7和HPV L1是LSIL患者臨床預后的預測因子，CK7和HPV L1聯合檢測有助于避免對LSIL患者的過度治療。Rauber等[12]對279例確診為CIN1/2的女性進行25個月的隨訪，對脫落細胞進行免疫組織化學分析發現病變的進展更多發生于HPV L1陰性的患者，在HPV L1陽性患者中病變不進展的陽性預測值為90.6%，HPV L1陰性患者中病變進展的陰性預測值為26%。國內一項對298例LSIL患者進行為期2年隨訪的回顧性研究發現，隨訪6個月、12個月、18個月、24個月時HPV L1蛋白陽性表達者病變消退率明顯高于HPV L1蛋白陰性表達者(26.3%比13.5%、59.8%比29.8%、68.0%比34.6%、73.7%比39.4%)(OR=0.438、0.286、0.249、0.232，均P<0.05)[13]。因此，對于HPV L1陽性的LSIL患者,可以適當放寬隨訪的時間間隔。

1.3E6/E7信使RNA(messenger RNA，mRNA) HPV的E6、E7基因是主要的致癌基因，由其編碼的HPV E6、E7蛋白是調節細胞周期的蛋白。HPV E6蛋白與p53抑癌蛋白結合，并以其為靶點加速泛素的降解。此外，E6蛋白還能激活角質形成細胞中端粒酶的活性。E7蛋白與腫瘤抑制蛋白Rb家族的蛋白結合，抑制細胞周期進程中所需基因的轉錄，p53和Rb的通路相互關聯[5]。Liu等[14]對171例患者的液基細胞學樣本進行E6/E7檢測發現，與HPV E6 mRNA及HR-HPV相比，HPV E7 mRNA與LSIL的進展密切相關,E7 mRNA的檢出率隨著病變程度的加重而顯著升高，E6 mRNA和HR-HPV的檢出率與病變進展并未表現出明顯的相關性，且與HR-HPV DNA的檢測或HPV16/18陽性率相比，E6和E7 mRNA特別是E7 mRNA對SIL病變進展的陽性預測值更高。Yang等[15]對1 024名受試者(其中732名受試者HPV E6/E7 mRNA陽性，292名受試者HPV E6/E7 mRNA陰性)的Meta分析表明，與陰性患者相比，HPV E6/E7 mRNA陽性患者在未來2年內發展為HSIL的風險更高。國內一項回顧性研究對81例CIN1患者進行隨訪，隨訪6個月內，HPV E6/E7 mRNA陽性組與陰性組進展率比較差異無統計學意義，而在隨訪12個月、18個月、24個月中，陽性組的總進展率明顯高于陰性組，E6/E7 mRNA表達水平越高，進展的可能性越大[16]。對于E6/E7 mRNA檢測陽性患者特別是高表達量的患者應提高警惕，而對于E6/E7檢測陰性患者可以根據情況適當延遲隨訪周期，避免不必要的陰道鏡檢查。但E6/E7 mRNA檢測對LSIL進展的預測價值仍需要更多的臨床樣本量及研究數據的支撐。

1.4病毒DNA的甲基化 甲基化是表觀遺傳學的一種常見過程，在腫瘤的發生中具有重要意義。HPV和宿主基因的DNA甲基化水平均隨著SIL病變程度的增加而升高。目前評估各種基因甲基化定量檢測中，最常見的是對宿主基因以及各種HPV基因組晚期區域的CpG位點的檢測，最常用的DNA甲基化檢測方法為甲基化特異性定量聚合酶鏈反應檢測和焦磷酸測序[17]。Bowden等[18]對HR-HPV陽性女性的Meta分析表明，HSIL較LSIL患者的HPV16 L1基因甲基化陽性率更高，HPV16 L1甲基化在HSIL與LSIL患者中的比值比為5.5，HPV16 L1/L2基因的甲基化在預測LSIL進展為HSIL甚至宮頸癌的靈敏度為77%，特異度為64%。但由于病毒分型的多樣及病毒甲基化標準值的制定存在一定難度，其臨床應用受限。s5甲基化評分法模型將人類抑癌基因紅細胞膜蛋白配體4.1樣3的DNA甲基化水平與HPV16、HPV18、HPV31和HPV33的晚期區域(即HPV L1/L2)的DNA甲基化水平相結合，即30.9(EPB41L3) +13.7(HPV16L1)+4.3(HPV16L2)+8.4(HPV18L2)+22.4(HPV31L1)-20.3(HPV33L2)。Louvanto等[19]對149例CIN2年輕女性患者進行的一項前瞻性研究表明，s5分類法是未經治療的CIN2女性患者病情進展與回歸的重要預測因子，即使在調整了細胞學結果、HPV16/18/31/33基因分型、年齡和吸煙對研究的影響后結果也如此，提示s5分類法對預測CIN2患者的預后具有重要預測意義。然而，有關s5分類法對LSIL病變進展預測價值的研究較為有限，s5分類法在LSIL患者中的應用仍需要深入研究。

1.5其他因素 沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核異酸輔酶依賴的去乙?；D移酶,是重要的抗衰老、抗代謝性疾病蛋白，其依據組織類型的差異而在不同的亞細胞中表達，其去乙?；富钚钥勺饔糜诮M蛋白和非組蛋白，從而調節細胞增殖、凋亡、衰老、代謝、應激反應等，其靶蛋白包括p53、pRb、錯配修復蛋白MLH1等。CIN和宮頸鱗癌患者的鱗狀上皮細胞中SIRT1的失調節可能與病毒致癌基因HPV E7有關，從而抑制細胞凋亡。Velez-Perez等[20]對101例患者的回顧性分析發現，SIRT1表達水平升高與SIL的病變進展密切相關，CIN1、CIN2、CIN3及宮頸癌中SIRT1過表達率分別為13.8%、40.6%、50%及100%。SIRT1過表達可能是預測LSIL進展的一個潛在生物標志物,但目前有關SIRT1的臨床研究較少，尚需要更多的前瞻性研究進一步證實其確切價值。

Pro ExC是拓撲異構酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,TOP2A)和微小染色體修復蛋白2 (minichromosome maintenance protein 2,MCM2)的“雞尾酒”抗體。TOP2A的表達在正常細胞中僅見于細胞周期的S期和G2/M期,但在腫瘤細胞中TOP2A表達率增高,在G0、G1期即可出現表達,故其主要在惡性增殖細胞中表達。MCM2是DNA復制許可蛋白，在細胞周期中從G0進入G1期前表達水平即開始升高,G1末期和S早期達到峰值，其在休眠細胞中呈低表達，在增生活躍的細胞中高表達，是DNA復制前復合物的重要組成部分，在DNA復制啟動和損傷修復中發揮重要作用，MCM2表達失調可導致細胞異常增殖及惡變傾向。宋麗娟等[21]對182例患者(其中正?；蚵詫m頸炎36例、LSIL 77例、HSIL 69例)的切片采用免疫組織化學法的研究表明，MCM2在正常對照組、LSIL組及HSIL組的陽性率分別為28%、50.6%、91.3%，MCM2陽性率隨著SIL分級的增加而逐漸增高，提示MCM2在SIL的病情進展中可能存在一定的預測價值。Ozaki等[22]對99例CIN1患者的隨訪資料進行回顧性分析表明，Pro ExC預測CIN1進展的靈敏度和特異度分別為86%、61%，Pro ExC可能是預測CIN1進展的潛在生物標志物。

2 宿主因素

SIL的發生發展是HPV與宿主免疫系統相互影響、相互作用的結果。SIL的進展不僅與HPV持續感染、病毒載量增加、HPV L1陰性表達、E6/E7 mRNA陽性表達、病毒DNA甲基化水平升高、SIRT1表達增加、ProEx C及MCM2陽性表達密切相關，也受宿主免疫水平的影響。

2.1人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)亞型 HLA在第6號染色體斷臂的主要組織相容性復合體中被發現。HLA基因具有高度多態性，通過介導抗原呈遞和細胞免疫反應識別、清除被病毒感染細胞，從而影響先天和適應性免疫系統，其已被證明是HPV持續感染和疾病進展的重要風險因素[23]。Matsumoto等[24]對454例患者進行的前瞻性研究發現，HLA-DRB1*1302基因在LSIL進展至HSIL的過程中發揮保護作用。Sastre-Garau等[25]對86例LSIL患者的前瞻性研究發現，HLA-DRB1*13基因與病變的消退存在關聯，HLA-DRB1*13基因陽性的患者中71.8%出現病變消退，90.5% HLA-DRB1*13基因陽性，而HPV16/18陰性的CIN患者在18個月內出現了病變的消退。Ferguson等[26]對539例組織學證實為CIN或宮頸癌的女性進行HLA-G等位基因測序發現，HLA-G多態性與CIN或HPV感染無關，而HLA-G*01∶01∶02及HLA-G*01∶06基因的表達與浸潤性癌的增加密切相關。HLA-G多態性是浸潤性宮頸癌發生的獨立危險因素。因此，檢測宿主基因可能對LSIL病變的進展具有預測價值。

2.2淋巴細胞增生反應 HPV具有免疫逃逸機制，人體對HPV感染的防御機制包括固有免疫應答和適應性免疫應答。T淋巴細胞在構建體液免疫和細胞免疫中具有重要作用。根據細胞表面的白細胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)分子的不同，淋巴細胞可以分為CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷細胞。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)主要由CD4+T細胞、CD8+T細胞組成，在抗腫瘤免疫中的作用已被廣泛報道，然而對這些T細胞亞群的改變在SIL進展過程中所起的作用研究較少。Maskey等[27]對72例宮頸活檢組織進行免疫組織化學分析，結果表明正常組織中TIL的比例較低，SIL中TIL的比例較高，且隨著SIL病變程度的加重TIL比例呈上升趨勢。一項研究對339例HPV持續感染患者宮頸刷檢物中的HPV-DNA、CD4*CD25*Foxp3*調節性T細胞進行檢測發現，HR-HPV DNA和調節性T細胞均對宮頸癌具有預測價值，且調節性T細胞預測宮頸癌的準確性較高，靈敏度和特異度分別為70.8%和88.8%，陽性預測值為78.6%，陰性預測值為83.7%，HR-HPV DNA和調節性T細胞并聯檢測的靈敏度高達93.3%，陰性預測值為93.2%，串聯檢測的特異度高達94.5%，陽性預測值為83.1%[28]。T細胞亞群分析是檢測體液和細胞免疫功能的重要指標，可反映機體當前的免疫功能、狀態及水平，有望成為SIL進展的預后性標志物。

2.3端粒酶的擴增 端粒是染色體末端的重復核苷酸序列，用于維持染色體的穩定，端粒酶能延長或縮短端粒。人端粒酶RNA(human telomerase RNA component，hTERC)基因在端粒延伸過程中起著模板作用，同時也是端粒酶發揮功能的重要組成部分，hTERC基因的表達與端粒酶活性一致，hTERC基因的突變、激活和擴增可能導致端粒酶活性增加。hTERC在許多正常組織和良性組織中均有表達，但其相對上調可以反映病變進展程度。Liu等[29]對150例接受宮頸活檢的患者進行研究表明，正常宮頸組織、LSIL、HSIL及浸潤性宮頸癌的患者中hTERC基因的擴增率分別為12.5%、34.2%、53.0%、85.7%；hTERC基因隨著病變程度的加重而增加，HR-HPV陽性組中hTERC基因擴增的患者多于HR-HPV陰性組。一項研究對54例CIN1患者進行隨訪發現，進展組、持續組、轉歸組中hTERC基因擴增陽性率分別為100%、47.37%、4.35%，各組比較差異有統計學意義[30]。hTERC基因可能與宮頸疾病中HR-HPV感染相關，是宮頸癌前病變的潛在標志物，hTERC基因檢測對宮頸病變的轉歸有一定的預測價值，也可用于CIN患者術后的隨訪。

3 細胞因子

正常的宮頸上皮細胞從基底層到表層的生理成熟過程需遵循細胞分裂周期的完整性和有序性。細胞基因組的完整傳遞是細胞在分裂增殖過程中最重要的部分，調節細胞周期的各個細胞因子相互協作才能確保DNA復制的精準性。若細胞周期因子出現異常表達，則可導致DNA復制紊亂，從而導致細胞的異常增生或不典型增生甚至癌變。

p16是一種調節細胞周期活動的周期蛋白依賴性激酶抑制劑。在正常細胞中，p16的表達水平較低，免疫組織化學方法難以檢測。p16在宮頸病變中的過表達被認為與HR-HPV E7癌蛋白的轉化活性相關。HPV感染宮頸細胞時，HPV產生E7蛋白，E7蛋白結合pRb并使pRb的抑癌作用受到抑制。Ki-67是一種細胞增殖標志物，除G0期外，在細胞周期的各個階段均有表達，有學者認為其是預測SIL進展的敏感性較高的生物學標志物[34]。Ki-67在調節細胞周期進程中發揮多種作用。隨著細胞周期的延長，其作用也不同，這與其在細胞中的分布不同有關。目前Ki-67作為宮頸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的預測及潛在治療靶點而受到廣泛關注。p16是腫瘤抑制因子，Ki-67是細胞增殖的細胞標志物。在生理狀態下，p16過表達與Ki-67的表達相互排斥，不會發生在同一宮頸上皮細胞中，p16/Ki-67共表達意味著HPV誘導的細胞周期解除，檢測p16/Ki-67共表達可作為預測HPV誘導的細胞轉化和SIL進展的標志物[34]。

Silva等[35]對p16、Ki-67進行免疫組織化學的系統回顧分析表明，p16和Ki-67在免疫組織化學中的過表達與SIL的嚴重程度和進展密切相關。Shi等[36]對64例女性患者(其中慢性宮頸炎10例、LSIL 12例、HSIL 20例、宮頸鱗癌22例)的回顧性分析表明，HSIL組和宮頸癌組患者的Ki-67和p16表達陽性率明顯高于LSIL組及正常宮頸組織組，但LSIL組與正常對照組比較差異無統計學意義，表明p16不能完全反映病變的嚴重程度，Ki-67、p16的表達與宮頸病變程度呈正相關，其表達水平也與宮頸病變程度呈正相關。但Quint等[37]對組織學確診為LSIL的238例患者進行了2年的隨訪發現，年齡(>30歲)及HPV分型是LSIL進展的預后因素，而非細胞周期標志物(p16、Ki-67、p53、pRb)。Sagasta等[38]認為雖然p16可用于CIN2的分流，但對LSIL病情進展的預測價值較低。因此，細胞周期標志物對LSIL進展的價值存在爭議，其預測意義有賴于更多前瞻性的大樣本對照性研究進一步證實。

4 陰道微生態

陰道微生態是由陰道解剖結構、宿主的內分泌系統、陰道微生物群及陰道局部免疫共同構成的生態系統。雌激素、局部pH值、乳桿菌以及陰道黏膜免疫系統在維持陰道生態平衡方面具有重要作用。Mitra等[39]對169例經活檢證實存在SIL或宮頸癌患者的陰道微生物群的研究表明，LSIL患者中出現缺乏乳桿菌的微生物群的概率為健康人群的2倍，而HSIL和宮頸癌患者中出現缺乏乳桿菌微生物群的概率分別為健康人群的3倍和4倍，提示乳酸菌可能是SIL進展的保護性因素。Liang等[40]進行的Meta分析表明，陰道微生態與HPV感染及SIL發生發展密切相關，細菌性陰道病、沙眼衣原體、解脲脲原體與HPV感染增加相關，陰道念珠菌病與HPV感染減少相關，細菌性陰道病與SIL發病風險增加相關。細菌性陰道病被認為能夠誘導炎癥反應，這些促炎狀態可導致組織損傷，并增加HPV的致癌潛能。一項研究表明，HSIL組及宮頸癌組患者中IgG含量、氨試驗陽性、優勢菌菌群失調、革蘭陽性短桿菌感染陽性、線索細胞陽性、白細胞酯酶及凝固酶陽性率明顯高于LSIL組及正常組織組，而分泌型IgA、白細胞介素-2水平明顯低于LSIL組及正常組織組；多因素回歸分析結果顯示，IgG水平升高、凝固酶陽性是宮頸病變的危險因素，而分泌型IgA、白細胞介素-2及白細胞介素-10水平升高是宮頸病變的保護因素[41]。陰道微生態顯示出顯著的個體可變性，且不同HPV亞型可能遵循不同的獨立病變過程，因此評估陰道微生物與HPV感染及SIL進展之間的關系具有挑戰性。陰道微生態的改變在CIN進程中所起的作用仍有待于更多研究及客觀指標進一步驗證，此外如何獲得不受污染的標本也是亟待解決的問題。

5 小 結

LSIL患者中有60%會出現病變消退，但因其具有向癌前病變甚至宮頸癌進展的可能，需要對這一部分進展人群進行較為密切的隨訪，因此尋求有效的LSIL進展的預測因素具有重要臨床意義。LSIL進展與HPV的持續感染、病毒載量增加、HPV L1陰性表達、E6/E7 mRNA陽性表達、病毒DNA甲基化水平升高、SIRT1表達增加、ProEx C及MCM2的陽性表達密切相關，對宿主基因進行檢測也為預測LSIL進展提供了新思路。但有關細胞周期調節因子p16及Ki-67在LSIL進展中的預測意義未來需進一步探究。目前尚未有明確的能夠預測LSIL進展并進入臨床應用的生物標志物，尋求有效的具有預測價值的生物標志物仍需更多前瞻性研究進一步證實。