胰腺導管腺癌差異基因表達及臨床預后分析

李自昂，王帆，王曉月，王倩，程潔，林軍

(武漢大學中南醫院消化內科，武漢 430072)

胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是一種極度惡性腫瘤，5年存活率<7%，中位生存期約為6個月，預后差[1-2]。PDAC能夠顯示出很大的細胞異質性，具有明顯的上皮和間充質癌細胞群，在PDAC小鼠模型中，白血病抑制因子可以通過調節癌細胞分化和上皮-間充質轉化狀態促進癌癥進展，而在PDAC患者中，間皮素高表達患者的中位生存期明顯短于低表達者，表明間皮素能夠促進胰腺癌的進展[3-5]。由于早期廣泛轉移和對化療藥物的耐藥作用，PDAC的死亡率較高[6]。有研究表明，免疫調節細胞(如髓樣來源的抑制細胞)在腫瘤發展和化學耐藥中起重要作用[7]。預計到2030年，PDAC將成為所有惡性腫瘤中的第二大常見癌癥類型[8]，但目前對該病的研究較少。因此，迫切需要尋找新的生物標志物，能夠預測PDAC的預后并作為PDAC潛在的治療靶點及檢測手段。本研究主要篩選與PDAC發展高度相關并影響其預后的基因，以期為未來研究胰腺癌進展途徑及靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1微陣列數據集來源 從GEO(Gene expression omnibus)在線數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取4個基因數據集[GSE(gene series expression)28735、GSE62165、GSE62452、GSE71989]和2個微RNA(microRNA,miRNA)數據集(GSE25820、GSE41372)。使用R 3.6.1中的程序包“limma”讀取，標準化和篩選差異表達的基因[9]。篩選|logFC|≥1且調整后P<0.05的基因作為差異基因。利用FunRich軟件篩選均在各數據集差異表達的基因和miRNA[10]。

1.2基因本體論(gene ontology，GO)富集通路和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析 使用注釋、可視化和集成發現數據庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)進行差異基因GO富集和KEGG通路分析[11]。高度富集于信號通路[偽發現率(false discovery rate，FDR)<0.05]的基因被認為參與PDAC的生物代謝途徑。R3.6.1的“GOplot”包用于可視化富集通路[12]。

1.3蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡和模塊的構建 采用String數據庫(https://string-db.org/)分析基因間的相互作用[13-14]。Cytoscape及其包含的功能組件MCODE(Molecular complex detection)用于構建可視化PPI網絡并分析不同的生物模塊[15-16]。

1.4miRNA靶基因的預測和預后分析 采用miRwalk網站(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRNet網站(https://www.mirnet.ca/)構建miRNA-基因互作網絡[17-18]。綜合差異基因、富集分析、miRNA靶基因篩選基因，并使用UCSC Xena在線工具(http://xena.ucsc.edu/)構建基因的表達聚類圖[19]。最后，使用Kaplan-Meier plot網站(http://kmplot.com/)評估這些基因對PDAC的臨床預后[20]。該網站根據基因中位表達水平分為高、低表達組，進而分析兩組5年生存率的差異。

2 結 果

2.1差異表達基因和差異表達miRNA GSE28735數據集包括45個腫瘤組織和45個相鄰正常組織。GSE62165數據集包含118個PDAC腫瘤組織和13個非腫瘤組織。GSE62452數據集包括69個胰腺腫瘤和61個相鄰的正常組織。GSE71989數據集包含8個正常胰腺組織和14個PDAC組織。GSE25820數據集的miRNA表達譜包括4個正常胰腺導管細胞，4個腺泡細胞，5個慢性胰腺炎和原發性PDAC的轉移組織。GSE41372數據集包含15個非腫瘤樣品和15個腫瘤樣品。從4個數據集中共獲得217個差異基因，見圖1；從2個miRNA數據集中獲得13個miRNA(hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-217、hsa-miR-145、hsa-miR-302c、hsa-miR-100、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-770-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1236、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-196a)，見圖2。

圖1 4個基因數據集差異表達基因

圖2 2個miRNA數據集差異表達miRNA

2.2GO富集和KEGG通路分析 DAVID數據庫中發現217個基因高度富集于8個生物學過程：細胞外基質組織、膠原分解代謝過程、細胞黏附、細胞外基質分解、蛋白水解、骨骼系統發育、膠原纖維組織、內胚層細胞分化，見圖3；8個細胞成分通路：細胞外空間、細胞外區域、細胞外基質、細胞外泌體、蛋白質細胞外基質、細胞表面、內質網腔和膠原三聚體，見圖4；5個分子功能通路：細胞外基質的結構成分、絲氨酸型內肽酶活性、整聯蛋白結合、鈣離子結合、膠原蛋白結合，見圖5；4個KEGG通路：蛋白質的消化吸收、細胞外基質-受體相互作用、胰腺分泌、黏著斑，見圖6。

圖3 8個重要的生物學過程

圖4 8個重要的細胞成分

圖5 5種重要的分子功能

KEGG：京都基因與基因組百科全書

2.3PPI基因網絡的構建和預后分析 通過GEO數據庫共獲得150個上調基因和67個下調基因。連接系數高于0.4的167個差異基因被用來構建PPI基因網絡互作圖。從這些互作基因中分析出10個重要的模塊，見圖7。在miRwalk數據庫中分析了6 711個miRNA靶基因。通過miRNA-基因網絡圖，發現在胰腺癌中鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ(protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta,PPM1D)是3個miRNA(hsa-miR-342-3p、hsa-miR-217、hsa-miR-770-5p)的共同靶點，見圖8。篩選出10個與PDAC顯著相關的基因，在UCSC xena數據庫中，從癌癥基因組數據集提取出4例正常樣本和177例腫瘤樣本，篩選出的10個基因均差異表達于腫瘤組織與非腫瘤組織(P<0.05,|logFC|>1)，見圖9。Kaplan-Meier plot網站收集了172例PDAC患者的臨床信息用于進行生存分析，總生存期設定為7 642 d，生存曲線顯示，纖連蛋白Ⅰ(fibronectin 1，FN1)、血小板反應蛋白2型(thrombospondin 2,THBS2)、Ⅻ 型膠原蛋白α-1鏈(collagen type Ⅻ alpha 1 chain，COL12A1)、Ⅵ 型膠原蛋白α-3鏈(collagen type Ⅵ alpha 3 chain，COL6A3)和載脂蛋白L1型(apolipoprotein L1，APOL1)高表達組患者的生存率較低，而PPM1D高表達組患者的生存率較高，見圖10～15。

PPI:蛋白質相關作用；紅色節點代表上調基因，藍色節點代表下調基因，線條代表每個基因之間相互作用

黃色節點代表miRNA，藍色節點代表基因，紅色節點代表PPM1D基因

FN1：纖連蛋白Ⅰ；IGFBP5:胰島素樣生長因子結合蛋白5；CDH11:鈣黏蛋白11；THBS2：血小板反應蛋白2型；COL12A1：Ⅻ型膠原蛋白α-1鏈；COL5A2：Ⅴ型膠原蛋白α-2鏈；CP:外殼蛋白；APOL1：載脂蛋白L1型；COL6A3：Ⅵ型膠原蛋白α-3鏈；PPM1D：鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ；紅色表示該基因在樣本中高表達，藍色表示該基因在樣本中低表達；在樣本組中，灰色表示正常組，黃色表示腫瘤組

PPM1D：鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ

FN1：纖連蛋白Ⅰ

THBS2：血小板反應蛋白2型

COL12A1：Ⅻ型膠原蛋白α-1鏈

COL6A3：Ⅵ型膠原蛋白α-3鏈

APOL1：載脂蛋白L1型

3 討 論

miRNA是一個小的非編碼調控RNA的大家族[21]。它們控制人類60%以上的蛋白質編碼和基因表達[22]。miRNA參與PDAC發展過程中的大多數遺傳突變，如幾乎所有PDAC病例中，miRNA介導的KRAS突變激活是胰腺導管上皮細胞轉化為腺癌的最早的遺傳變化[23]。這說明miRNA能夠通過調控基因活動參與癌癥的發展。我國胰腺癌導致的死亡在癌癥相關死亡中占比從2009—2019年增加了9%，因為人口老齡化及生活飲食等因素影響，這一比例還會繼續上升[24]。因此，對胰腺癌的機制進行研究將成為今后研究的重點。

本研究基于公眾數據庫，發現miR-342-3p、miR-217、miR-199b-5p,miR-770-5p調控的基因THBS2、FN1、COL12A1在胰腺癌組織中高表達，PPM1D、COL6A3、APOL1在胰腺癌組織中低表達。在功能富集方面，這些基因顯著富集于膠原分解代謝途徑、細胞黏附、細胞外泌體、絲氨酸型內肽酶活性和細胞外基質受體相互作用等通路。Kaplan-Meier曲線顯示，PPM1D、FN1、THBS2、COL12A1、COL6A3、APOL1表達與PDAC患者的預后顯著相關。PPM1D編碼的蛋白質是玉米2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的成員。該基因的表達以p53依賴的方式響應各種環境壓力而被誘導[25-26]。PPM1D通過下調凋亡刺激p53蛋白2增強Wnt/β聯蛋白途徑，促進胰腺癌細胞遷移和侵襲[27]。FN1編碼纖連蛋白，是糖蛋白的一種，在血漿中以可溶性二聚體的形式存在，在細胞表面和細胞外基質中以二聚體或多聚體形式存在。纖連蛋白參與細胞黏附和遷移過程，包括胚胎發生、傷口愈合、血液凝固、宿主防御和轉移[28-29]。在切除的PDAC組織中，FN1高表達于腫瘤瘤體更大且遠端淋巴結轉移的腫瘤組織[30]。THBS2編碼的蛋白質屬于血小板反應蛋白家族，是二硫鍵連接的同型三聚體糖蛋白，介導細胞與細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用[31]。臨床研究表明，PDAC的血清THBS2水平顯著高于高危人群，并且該基因在預后較差的患者中表達水平更高[32]。COL12A1編碼Ⅻ型膠原蛋白的α鏈，是具有三重螺旋間斷的原纖維相關膠原蛋白。Ⅻ型膠原蛋白是與Ⅰ型膠原蛋白結合的同型三聚體[33]。目前關于COL12A1與PDAC進展相關的研究較少。但有研究表明，COL12A1通過促分裂原活化的蛋白激酶通路維持的正反饋促進胃癌細胞的轉移[34]。COL6A3是Ⅵ型膠原蛋白編碼的α-3鏈，這是Ⅵ型膠原蛋白(在大多數結締組織中發現的珠狀細絲膠原蛋白)的三個α鏈之一。Ⅵ型膠原基因突變與Bethlem肌病有關，Bethlem肌病是一種罕見的常染色體顯性遺傳性近端肌病，伴有兒童早期發作[35]。Kang等[36]研究表明，COL6A3在胰腺癌組織及胰腺癌患者血清中顯著高表達，表明該基因參與PDAC的發生發展。APOL1編碼與載脂蛋白A-1結合的高密度脂蛋白。載脂蛋白A-1是一種相對豐富的血漿蛋白，是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白。它參與血漿中大多數膽固醇酯的形成，并促進膽固醇從細胞中流出。APOL1能夠導致腎損傷并且在腎臟足細胞中高表達，但損傷的具體機制仍不明確[37]。胰腺癌血清中APOL1基因表達水平顯著高于普通人群，受試者工作特征曲線結果顯示其可能成為PDAC的診斷標志物[38]。

綜上所述，10個miRNA靶基因在PDAC與正常組織中差異表達并參與其發生發展，其中PPM1D、FN1、THBS2、COL12A1、COL6A3和APOL1與PDAC預后相關。因此，進一步研究這些基因在胰腺癌中的作用，可能是治療胰腺癌，提高患者生存率的重要方向。