EDTA與EM復合菌劑聯合對鉛脅迫下黑麥草種子萌發、幼苗生長及鉛吸收的影響

周紅艷 陳麗珊 朱 瑛

（福建農業職業技術學院 福建福州 350119）

隨著我國工農業化的快速發展，鉛污染日益嚴重，對人類生存和健康造成了嚴重影響，已成為當今急需解決的重要環境問題。

植物修復技術已為環境中重金屬修復開辟了新的途徑，因其具有原位、經濟、環保、二次污染小等優點而被廣泛采用[1]。研究發現，草坪草作為應用較廣的綠化植物，具有生長快、適應性強、生物量大、抵抗力和固土力強的特點。因而對重金屬污染地區的污染修復，較其他物種更易達到去除效果，且吸收的重金屬更多，處理效率更高[2]。

植物提取修復技術主要通過收獲富集重金屬的植物而將重金屬帶出，從而降低環境中的重金屬含量。但是植物修復技術主要受限于植物生物量小、生長速度慢和重金屬有效性低而無法被植物吸收利用等問題[3]。若向土壤中添加人工合成的螯合劑，則可以活化污染土壤中的重金屬，增加土壤溶液中重金屬濃度。大量研究表明，可以通過物理、化學、微生物等輔助措施克服其修復過程中的限制因素，從而有效提高植物修復效率；螯合劑能不同程度地活化土壤中的重金屬并促進植物對其超量吸收[4,5]。螯合劑的劑量，使用方式、施用階段等都成為研究的熱點。楊卓通過盆栽試驗研究乙二胺四乙酸（EDTA）對印度芥菜修復鎘污染土壤的增效作用，研究表明，EDTA 的施入使得芥菜吸收鎘的量明顯增加[6]。白薇揚研究生物螯合劑EDDS 與非生物螯合劑EDTA聯合施用對玉米和油料作物重金屬鉛、銅、鎘的富集程度，表明螯合劑能夠增加植物中重金屬的富集，不同配比的生物螯合劑與非生物螯合劑效果不同[7]。EDTA可以阻止金屬的沉淀，使大量的重金屬進入土壤溶液，同時，以金屬螯合物的形式保護金屬不被土壤重新吸附[8]。Luo C 等研究發現，在土壤中添加EDTA 48 小時后，污染土壤中溶解性的銅、鋅、鉛、鎘含量分別比對照增加了102 倍、496 倍、114 倍和5 倍[9]。

降低重金屬對植物毒性和提高植物對重金屬的耐性，從而提高植物生物量是增強植物進行重金屬修復的重要途徑。EM 復合菌劑是日本琉球大學比嘉照夫教授研制出來的一種復合微生物制劑，由光合菌、乳酸菌、酵母菌等 80 多種厭氧性或嫌氧性微生物復合培養而成，不含任何化學有害物質，不污染環境。對于EM 復合菌劑降低動植物內重金屬已有較多報道。施用EM 復合菌劑可以達到對低濃度重金屬污染土壤進行微生物修復、降低重金屬含量、促進植物生長、提高植物抗性的目的[10-14]。梁小迪等采用盆栽試驗方法，研究了耐性細菌與活化劑（有機肥、EDTA、黃腐酸、檸檬酸）對黑麥草吸收鎘的影響，耐鎘菌劑與活化劑可提高鎘生物有效性、提高黑麥草對鎘污染土壤的生物修復效果，具有較好的應用推廣前景[15]。可見，采用EM 復合菌劑與非生物螯合劑EDTA共同誘導植物修復重金屬污染是一個值得探討的問題。

為此，本研究將探討EM 復合菌劑與非生物螯合劑EDTA 聯合施用對鉛脅迫下黑麥草種子萌發、幼苗生長及鉛吸收的影響。但至今為止，利用EM 復合菌劑與非生物螯合劑EDTA聯合施用對鉛污染的黑麥草修復效應方面的研究應用國內鮮見報道。且目前大部分種子萌發階段的研究都只是對于種子幼苗生長、發芽率等的研究，對重金屬吸收情況研究極少，EM 復合菌劑與非生物螯合劑EDTA 之間是否存在交互作用尚不清楚。為了更好地將生物與非生物措施相配合，因此開展了EM 與EDTA 聯合修復鉛的研究，旨在為合理進行植物—微生物—化學聯合修復重金屬污染提供技術支撐和科學依據。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

由千聚源種業公司提供黑麥草種子，江西天意生物技術有限公司提供EM 復合菌劑，天津市化學試劑批發公司提供EDTA（乙二胺四乙酸二鈉鹽）。

1.2 種子培養與試驗設計

1.2.1 種子培養

選取直徑為9 cm 的培養皿，以相應大小的二層濾紙作為發芽床，將配制好的不同濃度EM 溶液和EDTA 溶液倒入培養皿，對照（CK）不加EDTA 和EM，用水替代，保證每個培養皿內硝酸鉛濃度為200 μg/mL。每日稱重法加水至恒重，培養溫度為25 ℃，光照、黑暗周期分別為16 h、8 h。每個培養皿放入100 粒種子（試驗前將黑麥草種子用0.5%次氯酸鈉消毒1 h，用無菌水沖洗干凈，濾紙吸干，挑選顆粒飽滿的種子）。

1.2.2 試驗設計

試驗按2 因素3 水平隨機區組設計。因素1 為EM 溶液濃度，設低、中、高3 個水平，分別為EM0（0）、EM1（450 倍）、EM2（150 倍），表3中用E0、E1、E2 表示。因素2 為螯合劑EDTA 溶液濃度，設低、中、高3 個水平，分別為EDTA0（0）、EDTA1（5 mmol/L）、EDTA2（10 mmol/L）），表3中用A0、A1、A2 表示。共設9 個處理，每個處理設置3 個重復。2 因素水平如表1所示。

表1 因素及其水平

1.3 種子發芽、幼苗生長統計方法

每天觀察生長情況，第十天統計發芽率 （胚根長須達到種子長度一半才能計入）、第三天統計發芽勢。

發芽率=（第10 天正常發芽種子數/供試種子數）×100 %。發芽勢=（第3 天正常發芽種子數/供試種子數）×100 %。第10 天測量幼苗的根長、芽長，每個培養皿隨機選取10 株測定取平均值，地上部鮮重每個處理取地上部分分別稱重。

1.4 鉛含量原子吸收分光光度測定法

1.4.1 標準曲線繪制

用10 μg/mL 硝酸鉛標準溶液配制成濃度為0 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、3.00 μg/mL、4.00 μg/mL、5.00 μg/mL 的標準溶液，參照液體類樣品鉛含量檢測國標GB5009.12—2017 第三法火焰原子吸收法，用MIBK 萃取鉛導入火焰原子吸收分光光度計進行測定，按濃度與吸光度對應關系繪制標準曲線，曲線方程為y=0.0245 x+0.0362 。

1.4.2 樣品測定與儀器條件

第十天每個培養皿吸取0.3 mL 溶液與標準溶液相同方法進行鉛含量檢測。使用TAS-990 F 北京普析火焰原子吸收分光光度計，儀器工作條件如下：燃氣組成為空氣-乙炔；檢測波長為283.3 nm；燈電流為2 mA；乙炔流量為1 200 mL/min；空氣流量為8 L/min。

1.5 數據處理與分析

試驗所得數據用Excel 2016 進行初步處理，用SPSS 軟件進行方差分析和多重比較，P＜0.05 表示差異達顯著水平，P＜0.01 表示差異達極顯著水平。

2 結果與分析

表2 不同指標方差分析F 值

從表2可以看出，EM 復合菌劑與螯合劑EDTA 單因子及二因子（EM×EDTA）互作對黑麥草（芽長、根長、鮮重）和發芽勢、發芽率、鉛含量影響達顯著（P＜0.05）和極顯著水平（P＜0.01）（除EM×EDTA 對發芽勢影響差異不顯著外）。EM×EDTA 處理組合產生互作效應，下面進行單因素及二因子互作效應分析。

2.1 不同EM 與EDTA 處理濃度對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率和鉛含量影響的單因素效應

由圖1至圖6可以看出，不同濃度EM 處理對黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率的影響均以稀釋150 倍處理最大，且3 種濃度EM 處理水平均呈EM1 （150 倍）＞EM2（450 倍）＞EM0（0，CK）的變化趨勢，鉛含量表現趨勢相反。其中EM1 （150 倍）處理與EM2（450 倍）、EM0（0，CK）處理間差異分別達極顯著水平P＜0.01。EM1（150 倍）處理與EM0 對照相比，芽長、根長、鮮重、發芽率增幅分別達18.7%、34.5%、44.4%、31.7%，鉛含量下降了16 %。說明使用EM 菌劑促進了黑麥草種子的萌發與生長，同時使得鉛濃度下降，有利于環境中鉛的修復。

不同濃度EDTA 處理對黑麥草種子萌發和幼苗生長的影響可以從芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率上反映出來，方差分析結果表明處理間差異達顯著P＜0.05或極顯著水平P＜0.01。總體表現呈EDTA2（10 mmol/L）＜EDTA1（5 mmol/L）＜EDTA0（0，CK）的變化趨勢，鉛含量變化趨勢與之相反。EDTA 濃度越高對黑麥草的生長及發芽率抑制越大。這與其活化鉛的程度密切相關。當EDTA 濃度為5 mmol/L 時，與對照相比，芽長、根長、鮮重、發芽率抑制分別達63.3%、63.8%、74.0%、40.5%，當EDTA 濃度為10 mmol/L 時，芽長、根長、鮮重、發芽率抑制分別達82 %、92 %、92.7%、63.5%。鉛含量比對照分別增加了3.39 倍、6.82 倍。當EDTA 濃度為10 mmol/L 時，根長、鮮重極顯著下降，其中根長只有0.27 cm，與對照3.37 cm相比較下降了11.5 倍，鮮重下降了12.8 倍，表現出明顯的鉛危害。因為根是植物體絡合重金屬重要的部位，也是最易受重金屬毒害的部位。根據前人的研究，植物的根系和地上生物量的積累有利于吸收重金屬，根長的變化可作為植物受重金毒性影響的一個重要指標[17]。可見在EDTA 濃度為10 mmol/L 時抑制過大。在本試驗條件下，EDTA 濃度在5 mmol/L 時，相對有利于鉛的吸收，從而達到更好的修復效果。

2.2 EM 與EDTA 互作對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率以及鉛含量的影響

從表3數據可以看出，在同一E（EM）水平下，不同濃度A(EDTA)處理間達極顯著水平（P＜0.01），其濃度越高，對黑麥草的生長及發芽率抑制越大，重金屬活化程度也越高。雖然A2（10 mmol/L）水平重金屬活化達到最大，但是根長、鮮重等與對照相比抑制都達到了十幾倍。A1（5 mmol/L）水平與A2（10 mmol/L）水平相比，在相同EM 水平下重金屬濃度活化程度雖然下降1 倍多，但是芽長、根長、鮮重、發芽率指標均在2～5 倍之間增長，植物根系與地上生物量是吸收重金屬的重要部位，所以EDTA濃度應適當控制在相對合理的濃度，否則不利于植物生長，影響重金屬的吸收。

表3 相同EM 水平下，不同EDTA 濃度處理對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率和鉛含量的影響

對于同一A（EDTA）水平下，不同E（EM濃度）處理對鉛脅迫下黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率的影響（見表3）總體呈E1＞E2＞E0 的變化趨勢，而鉛含量呈相反的變化趨勢。說明EM 濃度150 倍的條件下，對黑麥草芽長、根長、鮮重、發芽勢、發芽率的影響差異最大。EM 與EDTA 聯合使用與單獨使用EDTA 相比，都能夠促進黑麥草生長和種子萌發。兩種制劑綜合作用，使得重金屬濃度下降，從而減輕了重金屬對黑麥草的毒害作用，有利于重金屬污染的修復。

3 結論

綜上所述，使用EM 復合菌劑可明顯促進黑麥草種子的萌發與幼苗生長，從而更好吸收溶液中的鉛，150 倍濃度的EM 有利于環境中鉛的吸收。EDTA 濃度越高重金屬活化程度越高，但是對黑麥草的生長及發芽率抑制也越大。根系與地上生物量作為吸收重金屬的重要部位應考慮其生長受抑制程度，在本試驗條件下，EDTA 濃度5 mmol/L 為相對合理的濃度，濃度不宜超過10 mmol/L，否則可能對植物生長和重金屬修復帶來不利影響。EM 與EDTA 產生明顯的交互作用，兩者的合理配合使用，能緩解重金屬對黑麥草的毒害作用，有利于重金屬污染的修復。綜合考慮，以噴施150 倍EM 菌劑及5mmol/L 的EDTA 混合劑處理效果最佳。

黑麥草的苗期生長與其生理響應息息相關，進一步分析植物體內重金屬的變化可以更加清楚了解重金屬的動態變化及產生的生理機制。但是本研究在苗期階段受到重金屬脅迫部分處理樣品量不足，后續應通過盆栽及田間種植等進行進一步研究。

4 討論

在本實驗中，EM 菌劑可以促進黑麥草的生長和種子的萌發，溶液中鉛濃度下降，說明使用EM 復合菌劑可以達到鉛污染的微生物修復目的，這可能與黑麥草地下部和地上生物量的增加有關。植物生物量低，特別在種子萌發期生長緩慢，對鉛的耐受性有限。通過植物促生菌可促進植物生長，提高植物耐受性，從而達到重金屬污染修復的目的，這與前人的觀點一致[18,19]。

作為一種被廣泛應用的重金屬植物—微生物—化學聯合修復方法，黑麥草對重金屬的富集能力有限。而EDTA可以在不同程度活化重金屬的同時誘導植物對重金屬的超量吸收[20]。不過濃度過高也可能抑制植物生長，對重金屬污染修復產生不利[21]。因此，本實驗中對黑麥草生長中同時使用增強重金屬耐性的EM 復合菌，試驗可行且具有一定的創新性，為進一步進行盆栽及大規模試驗提供理論支撐。但是，雖然誘導植物提取重金屬的研究在實踐應用中擁有很好的潛力，且生態風險相對更小，但仍應充分考慮到EDTA對重金屬的植物修復受各種因素的影響，如植物品種、環境中重金屬污染狀況和其本身特性，以及EDTA的過量使用可能造成的二次污染等。與此同時，對于能促進黑麥草對重金屬鉛吸收的微生物，應加強EM 復合菌群中更多功能菌的篩選和功能特點的深入研究，從而建立一條有效的植物—微生物—化學修復重金屬污染途徑。