黃酮類化合物對銅綠微囊藻的抑制作用

邢春玉 孫浩晨

（天津天獅學院 天津 301700）

目前，針對藍藻水華的控制技術可以歸納為物理、化學、生物三類，各類技術均有明顯的特點，但也均存在一定的局限性。物理方法可分為工程除藻和直接物理除藻，雖然見效快，但耗費人力、物力，且易復發[1-2]；化學方法往往只能短期奏效，且容易造成“二次污染”[3]；生物方法強調的是整個生態系統的管理，從營養環節來控制藍藻生長，具有經濟、高效、環保的優點。水生植物對藍藻的抑制可以通過營養競爭、調節水體的氮磷比例來實現，還可以通過其分泌的化感物質來顯著抑制藍藻生長[4-6]。化感物質在水體生態修復中的應用研究備受關注，酚酸類、黃酮類、生物堿類等物質是目前發現數量最多且活性較強的化感物質[7-9]，其中黃酮類化感物質具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，在控制水華藻類方面得到了越來越廣泛的研究和關注[10]。文章選取蘆丁和槐米中提取的黃酮類化合物進行抑藻試驗，通過研究其對銅綠微囊藻藻細胞密度和葉綠素a含量的影響，為藍藻水華的治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗所用銅綠微囊藻（型號FACHB-1328 ）購于武漢水生生物研究所淡水藻種庫，蘆丁標準品（UV≥98 %）購自天津市盛淼科技有限公司，槐米購買于中藥市場。

1.2 研究方法

1.2.1 銅綠微囊藻的擴大培養

將藻種接種到BG11 培養基中，在溫度為25 ±1℃，光照強度4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h 條件下培養，每4 h 搖動一次，培養3～4 d 達到對數期，進行試驗。

1.2.2 試驗設計

（1）蘆丁對銅綠微囊藻的抑制作用研究

配置蘆丁BG11 溶液，使其濃度為45 mg/L、75 mg/L、105 mg/L，經0.22 μm 濾膜除菌。在無菌條件下準確吸取除菌后的蘆丁BG11 溶液10 mL 和處于對數期的藻液40 mL加入100 mL BG11 培養基中，使得藻液中蘆丁最終濃度為3mg/L、5mg/L、7mg/L。銅綠微囊藻的初始藻密度為0.15×105cells/mL。接種后在溫度為25 ±1℃，光照4000 lx，光暗比為12 h∶12 h 的環境條件下培養。每天測定其藻細胞密度和葉綠素a 含量，觀察銅綠微囊藻的生長情況。

（2）槐米黃酮化合物對銅綠微囊藻的抑制作用研究

準確稱取經干燥、粉碎后的槐米1 g、2 g、4 g。按照料液比1∶20 加入60 %的乙醇溶液，60 ℃下水浴處理30 min，在超聲溫度為60 ℃，功率為200 W 的條件下提取30 min 后，將提取液置于4 000 r/min 的離心管中離心10 min，取上清液于旋轉蒸發儀中濃縮。待濃縮后倒入100 mL BG11 培養基，搖勻后經0.22 μm 的濾膜除菌。在無菌條件下準確吸取除菌后的槐米BG11 溶液10 mL 和處于對數期的菌液40 mL 加入100 mL BG11 培養基中，設置一個空白對照，3 個處理組中黃酮濃度分別為5.28 mg/L、8.94 mg/L、11.86 mg/L。每隔24 h 測定其藻細胞密度和葉綠素a 的含量。

1.2.3 試驗指標的測定方法

（1）藻細胞密度的測定

取搖勻后的藻液，采用25×16 型號血球計數板進行計數。藻類抑制率公式為：IR=(1-Nt/Mt)×100 %，式中IR為抑制率，Nt為處理組第t 天藻細胞密度，Mt為對照組第t 天藻細胞密度。

（2）葉綠素a 含量的測定

取銅綠微囊藻藻液10 mL 置于離心管中，4 500 r/min 離心10 min，取底部藻細胞置于研缽中，進行研磨，分3 次加入95 %乙醇，使總體積為10 mL。提取葉綠素后置于4 000 r/min 的離心管中離心10 min，取上清液，以95 %乙醇做空白對照，分別在波長665 nm、649 nm 下測其吸光度值。根據公式Ca（mg/L）=13.95 OD665-6.88 OD649計算葉綠素a 的含量。

（3）蘆丁及槐米黃酮化合物含量的測定

采用分光光度法測定蘆丁及槐米總黃酮的含量[11]。

1.2.4 數據處理與分析

利用Excel 軟件進行數據統計分析，采用sigmaplot 12.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蘆丁對銅綠微囊藻藻密度的影響

從圖1可以看出，不同濃度蘆丁對銅綠微囊藻均表現出抑制作用。隨著培養時間的延長，蘆丁對銅綠微囊藻抑制作用明顯增加，在蘆丁濃度為7mg/L 處理組中，培養7d后，銅綠微囊藻抑制率可達到57.23 %（見表1）。

表1 蘆丁對銅綠微囊藻的抑制率（%）

2.2 槐米黃酮對銅綠微囊藻藻密度的影響

圖2顯示了不同濃度槐米黃酮提取物對銅綠微囊藻的影響。在藻類培養初期，對照組和處理組中藻細胞密度差別不大，從第3 天開始對照組中藻細胞呈指數增長，處理組藻細胞增長緩慢。11.86 mg/L 槐米黃酮對銅綠微囊藻的抑制率可達到73.20%。

表2 槐米黃酮化合物對銅綠微囊藻的抑制率（%）

2.3 蘆丁對銅綠微囊藻葉綠素a 含量的影響

葉綠素a 含量的變化可以揭示出藻類的生長情況，如圖3所示，不同濃度蘆丁處理組中銅綠微囊藻中葉綠素a 含量均顯著低于對照組，對照組中葉綠素a 含量一直保持較高的水平。說明蘆丁可以進入藻細胞，破壞藻類的光合系統，引起葉綠素a 的降解，以此來抑制藻類的生長。

2.4 槐米黃酮化合物對銅綠微囊藻葉綠素a 含量的影響

加入槐米黃酮化合物的銅綠微囊藻處理組和對照組藻葉綠素a 含量變化如圖4所示。培養7 d 后，對照組中葉綠素a 的含量明顯增加。與對照組相比，處理組中葉綠素a 含量表現出升高緩慢或下降的趨勢。從圖4可以看出3 個處理組中葉綠素a 含量變化與藻密度的變化趨勢基本一致。

3 結論

本研究中蘆丁及槐米中提取的黃酮類化合物對銅綠微囊藻均表現出一定的抑制作用，根據藻細胞密度和葉綠素a含量變化來揭示黃酮類物質對藻類的抑制情況，得出如下結論：

（1）蘆丁對銅綠微囊藻的生長具有抑制效果，在不同濃度下抑制效果不同：濃度越高，對藻類的抑制效果越明顯，使得藻細胞密度降低，葉綠素a 含量下降。

（2）槐米中提取的黃酮類化合物對銅綠微囊藻的生長亦具有抑制效果，且抑制作用較強；在11.86 mg/L黃酮類化合物培養藻類7 d，抑制率可達到73.20%。

（3）黃酮類化合物可通過影響銅綠微囊藻的光合作用系統來抑制其生長。黃酮類化合物的存在會降低藍藻細胞的葉綠素a 含量，通過降低藻細胞的光能利用率從而影響其光合作用。

本研究中蘆丁及槐米黃酮化合物能有效抑制銅綠微囊藻的生長，因植物中提取的黃酮類化合物本身具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用，且成本低，不會引發水環境污染，因此可廣泛運用到藍藻水華的治理中。