血液循環中微小RNA-140-3p和Toll樣受體4表達與冠心病患者經皮冠狀動脈介入術后支架內再狹窄的關系研究

馮六六，白艷艷，史駿，劉天華，劉新兵，單蓉

本研究價值：

近年在心血管疾病的病理機制和靶點研究中，微小RNA（miRNAs）因具有高度保守性和表達時序性，在循環系統中表達相對穩定，而頗受研究者關注，是一種理想的分子標志物。目前研究已證實，多種miRNAs對冠心病具有一定診斷價值，但與經皮冠狀動脈介入術（PCI）后支架內再狹窄的關系研究較少。本研究發現血液循環中miR-140-3p和Toll樣受體4（TLR4）表達對冠心病患者PCI后支架內再狹窄的預測價值較高，可作為預測冠心病患者PCI后支架內再狹窄的生物標志物。

經皮冠狀動脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）能夠在緊急情況下快速開通梗死血管，緩解心肌損傷，是冠心病患者的主要血運重建方法，但術后支架內再狹窄的發生在很大程度上影響了患者的預后［1-2］。近年有學者提出支架內新生動脈粥樣硬化（in-stentneoathe neoatherosclerosis，ISNA）的概念，并認為ISNA是PCI后支架內再狹窄的主要原因［3］。病理學研究發現，在ISNA中存在大量富含脂質的巨噬細胞及局部浸潤的淋巴細胞、嗜酸粒細胞，這一發現揭示了免疫炎性反應在ISNA發生、發展過程中發揮著重要作用。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）是參與冠心病循環系統炎性反應和內皮功能損傷的經典標志物，其與斑塊產生及破裂密切相關［4］。本研究旨在分析血液循環中TLR4、微小RNA（miR）-140-3p表達與冠心病患者PCI后支架內再狹窄的關系，并發現調控TLR4的上游miR-140-3p也是冠心病的潛在生物標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取上海市楊浦區市東醫院2016年7月—2017年12月收治的行PCI的285例冠心病患者作為病例組，均符合《臨床冠心病診斷與治療指南》［5］中的冠心病診斷標準，并具備PCI指征。根據有無發生支架內再狹窄將冠心病患者分為再狹窄亞組（n=44）和無再狹窄亞組（n=241）。另選取同期在上海市楊浦區市東醫院進行健康體檢的300例中老年（45～75歲）健康志愿者作為對照組。本研究經上海市楊浦區市東醫院倫理委員會審核批準（倫理號：2016-012-01），所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）臨床病理資料完整；（2）隨訪資料完整，且隨訪時間≥2年。排除標準：（1）合并傳染性疾病者；（2）合并免疫系統疾病者；（3）合并腫瘤者；（4）合并任何原因引發的感染者；（5）合并哮喘或過敏體質者。

1.3 觀察指標

1.3.1 臨床資料 詳細統計患者的臨床資料，主要包括人口學特征、合并癥、生活習慣、實驗室檢查指標、影像學資料。其中人口學特征包括年齡、性別、身高、體質量，并計算體質指數（BMI）。合并癥包括高血壓、糖尿病發生情況。生活習慣包括吸煙、飲酒及熬夜情況，吸煙定義為吸煙指數（平均每日吸煙支數×吸煙年數）≥50支年；飲酒定義為平均乙醇攝入量＞25 g/d；熬夜定義為平均超過24：00入睡≥3 d/周。實驗室檢查指標包括血脂四項〔總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）〕、空腹血糖、心肌酶譜〔肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）〕、炎性標志物〔超敏C反應蛋白（hs-CRP）、降鈣素原（PCT）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）〕及外周血miR-140-3p、TLR4表達情況，其中血脂四項、空腹血糖、心肌酶譜及炎性標志物均采用羅氏診斷產品（上海）有限公司提供的cobas ?c 311全自動生化分析儀及其配套試劑或試劑盒進行檢測。采用熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測兩組受試者外周血miR-140-3p、TLR4相對表達量，主要步驟如下：（1）冠心病患者于PCI前、健康志愿者于體檢當天抽取血樣本，-80 ℃超低溫環境下存儲血樣，且未經過反復凍融。（2）取出血樣并于無菌操作臺上處理，先在冰上自然溶解，然后采用miRNAs提取試劑盒（檢測miR-140-3p）或總RNA提取試劑盒（檢測TLR4）提取全血樣本的miRNAs或總RNA，鑒定RNA質量是否合格。（3）采用通用的RT-PCR試劑盒進行反轉錄，根據說明書要求配置常規反轉錄體系，置入PCR管，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s，4 ℃存貯，準備擴增。（4）根據試劑盒要求配置擴增體系，引物如下：miR-140-3p正向引物5'-ACACTCCAGCTGGGAGGCGGGGCGCCGCGGG A-3'，反向引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。TLR4正 向引物5'-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3'，反向引物5'-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3'；GAPDH正 向引物5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反向引物5'-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3'。（5）擴增完成后，根據公式（2-ΔΔCt）分別計算 miR-140-3p、TLR4相對表達量。影像學資料主要包括冠狀動脈狹窄支數、冠狀動脈狹窄率及左心室射血分數（LVEF）。

1.3.2 PCI情況 記錄患者支架植入情況（包括支架長度、內徑）、隨訪期間支架內再狹窄發生情況。支架內再狹窄判斷標準：PCI后出現血管介入部位心肌梗死、心絞痛，或復查冠狀動脈造影顯示支架內、近端及遠端5 mm范圍的管腔直徑狹窄率≥50%，參考血管為支架遠端5 mm外的正常血管［6］。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件和MedCalc v19.0.7分析數據。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（QR）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗；冠心病患者PCI后支架內再狹窄的影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析；繪制ROC曲線以評價PCT、miR-140-3p相對表達量、TLR4相對表達量及LVEF對冠心病患者PCI后支架內再狹窄的預測價值，并采用Hanley-McNeil非參數法比較曲線下面積（AUC）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組與對照組外周血miR-140-3p、TLR4相對表達量比較 病例組患者miR-140-3p相對表達量低于對照組，TLR4相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 病例組與對照組miR-140-3p、TLR4相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression levels of miR-140-3p and TLR4 between case group and control group

表1 病例組與對照組miR-140-3p、TLR4相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of relative expression levels of miR-140-3p and TLR4 between case group and control group

注：miR-140-3p=微小RNA-140-3p，TLR4= Toll樣受體4

組別 例數 miR-140-3p TLR4對照組 300 0.852±0.165 0.301±0.127病例組 285 0.660±0.198 0.523±0.164 t值 12.766 18.358 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.2 再狹窄亞組與無再狹窄亞組患者臨床資料及支架植入情況比較 再狹窄亞組與無再狹窄亞組患者年齡、性別、BMI、高血壓發生率、吸煙率、飲酒率、熬夜者所占比例、TC、TG、LDL-C、HDL-C、CK、CK-MB、TNF-α、IL-6及冠狀動脈狹窄支數、支架長度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；再狹窄亞組患者糖尿病發生率、空腹血糖、hs-CRP、PCT、TLR4相對表達量及冠狀動脈狹窄率高于無再狹窄亞組，miR-140-3p相對表達量及LVEF低于無再狹窄亞組，支架內徑小于無再狹窄亞組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2～3）。

2.3 冠心病患者PCI后支架內再狹窄的影響因素 將表2～3中有統計學差異的指標作為自變量（其中空腹血糖與糖尿病存在明顯共線性，剔除檢驗統計量值較小的空腹血糖，僅保留糖尿病），將支架內再狹窄作為因變量（賦值：無=0，有=1），進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，糖尿病、PCT及TLR4相對表達量是冠心病患者PCI后支架內再狹窄的危險因素，而miR-140-3p相對表達量、LVEF及支架內徑是冠心病患者PCI后支架內再狹窄的保護因素（P＜0.05，見表4）。

表2 再狹窄亞組與無再狹窄亞組患者人口學特征、合并癥、生活習慣及實驗室檢查指標比較Table 2 Comparison of demographic characteristics，complications，living habits，laboratory examination indexes between restenosis subgroup and nonrestenosis subgroup

表3 再狹窄亞組與無再狹窄亞組患者影像學資料及支架植入情況比較Table 3 Comparison of imaging data and stent implantation between restenosis subgroup and non-restenosis subgroup

表4 冠心病患者PCI后支架內再狹窄影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

2.4 PCT和miR-140-3p、TLR4相對表達量及LVEF對冠心病患者PCI后支架內再狹窄的預測價值 PCT和LVEF是冠心病患者的常規監測指標。ROC曲線分析結果顯示，miR-140-3p、TLR4相對表達量預測冠心病患者PCI后支架內再狹窄的AUC與PCT比較，差異無統計學意義（Z值分別為0.139、1.307，P值分別為0.889、0.121）；但高于LVEF，差異有統計學意義（Z值分別為6.634、6.669，P值均＜0.001，見表5、圖1）。

表5 PCT和miR-140-3p、TLR4相對表達量及LVEF對冠心病患者PCI后支架內再狹窄的預測價值Table 5 Predictive value of PCT，miR-140-3p relative expression level，TLR4 relative expression level and LVEF in predicting in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

3 討論

圖1 PCT和miR-140-3p、TLR4相對表達量及LVEF預測冠心病患者PCI后支架內再狹窄的ROC曲線Figure 1 ROC curve for PCT，miR-140-3p relative expression level，TLR4 relative expression level and LVEF in predicting in-stent restenosis after PCI in patients with CHD

冠心病是臨床上最常見的心血管疾病之一，其病理基礎為冠狀動脈粥樣硬化導致管腔狹窄或閉塞，進而引起心肌缺氧缺血性損傷。既往研究表明，冠心病的發生、發展受到多方面因素影響，且相關因素之間又存在交互影響，其中炎性反應、斑塊破裂及血栓形成是冠心病的三大病理機制，且三者之間緊密聯系、相互促進，共同推動病情進展，如炎性反應可促進細胞和血小板黏附，誘導斑塊形成并促進斑塊破裂，而斑塊破裂反過來又促進了栓子形成，并與栓子共同加劇了炎性反應［7］。近年，ISNA理論的提出進一步揭示了炎性反應在冠心病發生發展中的重要作用，也使免疫炎性反應在PCI后支架內再狹窄中的介導作用受到更多重視。TLR是人體固有免疫應答中的主要成員之一，在免疫防御和炎癥應答中發揮著重要作用，其中TLR4與核轉錄因子κB（NF-κB）組成的TLR4/NF-κB信號通路可通過調節炎性反應和細胞凋亡過程而參與冠心病的病理進程［8-9］。因此，本研究以TLR4為切入點，尋找與冠心病患者PCI后支架內再狹窄相關的生物標志物。

miRNAs是一類含有17～25個核苷酸、高度保守的小分子非編碼RNA，其廣泛存在于病毒、植物及高等哺乳動物中，是最大的基因家族之一。在功能方面，miRNAs雖然不具有編碼蛋白質的作用，但可以通過與靶基因結合而沉默靶基因表達，抑制其下游信號通路活性［10］；此外，miRNAs還可以通過外泌體實現細胞間信號傳遞，參與細胞間信息交流［11］。現有研究證實，部分miRNAs在維持內皮細胞穩定性和保護心肌細胞方面發揮著重要作用，是心血管疾病的潛在生物標志物［12-13］。與CRP、TNF-α等炎性遞質不同，miRNAs在循環系統中具有高度穩定性，因此其又被認為是一種理想型生物標志物。miR-140-3p是TLR4的上游miRNAs，兩者呈負調控關系。劉靜等［14］研究表明，miR-140-3p對冠心病不良心血管事件具有預測價值，提示miR-140-3p與冠心病病理機制有關。

本研究結果顯示，病例組患者miR-140-3p相對表達量低于對照組，TLR4相對表達量高于對照組；再狹窄亞組患者miR-140-3p相對表達量低于無再狹窄亞組，TLR4相對表達量高于無再狹窄亞組，提示血液循環中miR-140-3p、TLR4表達可能與冠心病及ISNA有關；本研究進一步進行多因素Logistic回歸分析結果顯示，糖尿病、PCT及TLR4相對表達量是冠心病患者PCI后支架內再狹窄的危險因素，而miR-140-3p相對表達量、LVEF及支架內徑是冠心病患者PCI后支架內再狹窄的保護因素，與既往研究支持的糖尿病、PCT促進PCI后支架內再狹窄發生，LVEF高、支架內徑大利于預防PCI后支架內再狹窄發生的結論一致［15-16］。既往研究表明，TLR4異常升高增加了PCI后支架內再狹窄發生風險［17-18］。但目前國內外關于miR-140-3p與PCI后支架內再狹窄關系的研究報道少見。PCT和LVEF是冠心病患者的常規監測指標。本研究ROC曲線分析結果顯示，miR-140-3p、TLR4相對表達量預測冠心病患者PCI后支架內再狹窄的AUC分別為0.866、0.798，與PCT（0.862）相當，但高于LVEF（0.531），提示血液循環中miR-140-3p、TLR4表達對冠心病患者PCI后支架內再狹窄具有一定預測價值。

綜上所述，血液循環中miR-140-3p和TLR4表達是冠心病患者PCI后支架內再狹窄的影響因素，且二者對冠心病患者PCI后支架內再狹窄的預測價值較高，可作為預測冠心病患者PCI后支架內再狹窄的生物標志物。

作者貢獻：馮六六進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析、結果分析與解釋，負責撰寫及修訂論文；馮六六、史駿、劉天華、劉新兵、單蓉進行數據收集、整理、分析；白艷艷負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。