2型糖尿病患者載脂蛋白E基因多態性與腦血管并發癥的關系研究

高銀婷，孔璐璐，李偉，

本研究價值：

本研究分析2型糖尿病（T2DM）合并腦卒中患者的載脂蛋白E（ApoE）基因型，并探討ApoE基因多態性與T2DM合并腦血管并發癥的關系，結果顯示，ApoE基因型是T2DM患者發生腦血管并發癥的影響因素，其中具有ApoE E3/E4基因型的T2DM患者發生腦血管并發癥的風險增加，其機制可能與ApoE基因型可影響總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白B（ApoB）水平有關。本研究從微觀基因表型水平探討了T2DM患者合并腦血管并發癥的可能機制，可為臨床提供借鑒。

近年來，全球2型糖尿病（T2DM）的發病率迅速增加，而T2DM患者合并慢性并發癥是導致其死亡的主要原因［1］。T2DM合并的慢性血管并發癥主要有微血管病變如腎臟病、視網膜病變、糖尿病周圍神經病變及大血管并發癥如腦血管病變、冠狀動脈病變等。血脂異常或脂蛋白異常可能加重T2DM患者的微血管和大血管并發癥，并促進動脈粥樣硬化［2］。載脂蛋白是構成血漿脂蛋白的重要成分，在血漿脂蛋白代謝中具有重要作用，其中載脂蛋白E（ApoE）在人體中主要參與、調節機體的血脂代謝。既往研究表明，ApoE基因多態性與體內血脂水平密切相關［3］。基于此，本研究分析T2DM合并腦卒中患者的ApoE基因型，并探討ApoE基因多態性與T2DM合并腦血管并發癥的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月—2019年1月于徐州醫科大學附屬醫院內分泌科住院的T2DM患者212例。其中男131例，女81例；年齡44～85歲，平均（64.2±6.8）歲；合并腦卒中（出血性腦卒中59例和缺血性腦卒中55例）114例（病例組），未合并腦卒中98例（對照組）。病例組中男76例，女38例；年齡46～85例，平均（65.0±5.6）歲；體質指數（BMI）（23.0±3.3）kg/m2；糖尿病病程（13.1±7.6）年；基線糖化血紅蛋白（9.1±2.2）%。對照組中男55例，女43例；年齡44～85歲，平均（64.7±7.3）歲；BMI（22.9±3.4）kg/m2；糖尿病病程（3.4±3.0）年；基線糖化血紅蛋白（8.8±2.5）%。兩組性別（χ2=2.482，P=0.115）、年齡（t=0.330，P=0.744）、BMI（t=0.217，P=0.828）、基線糖化血紅蛋白（t=0.929，P=0.354）比較，差異無統計學意義；病例組糖尿病病程長于對照組，差異有統計學意義（t=-11.835，P＜0.001）。本研究經徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會審核通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）符合1999年WHO制定的T2DM診斷標準［4］，且病情穩定；（2）合并腦卒中者符合全國第四屆腦血管病會議中的腦卒中診斷標準［5］，且進行常規藥物治療，血糖可控。排除標準：（1）有糖尿病家族史者；（2）合并高血壓、原發性腦血管疾病、嚴重心/肝/腎臟疾病、血液病、嚴重感染及甲狀腺功能異常等者；（3）有服用降脂藥物史者；（4）吸煙者。

1.3 研究方法

1.3.1 ApoE基因型檢測 采用EDTA-K2抗凝管，分別采集兩組患者入院第2天清晨空腹外周靜脈血2 ml，3 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），分離、提取人類基因組DNA，并儲存于-20 ℃以下環境中。提取DNA，應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測 ApoE2 526（C＞T）/ApoE4 388（T＞C）位點，通過熒光曲線判讀基因型。采用ABI 7500熒光定量PCR擴增儀，檢測試劑盒為人ApoE基因檢測試劑盒（武漢友芝友醫療科技股份有限公司生產）。ApoE基因型檢測由徐州醫科大學附屬醫院感染科實驗室完成。計算患者ApoE基因型、等位基因頻率。

1.3.2 血脂指標檢測 采用黃色促凝膠真空采血管分別采集兩組患者入院第2天清晨空腹外周靜脈血3 ml，3 000 r/min離心15 min（離心半徑15 cm），分離血清，采用全自動生化分析儀（貝克曼庫爾特公司生產，AU-5800）及配套試劑檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白A1（ApoA1）、載脂蛋白B（ApoB）。所有檢測流程嚴格按照說明書進行操作。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件處理數據。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；T2DM患者發生腦血管并發癥的影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ApoE基因型檢測結果 本研究共檢出4種常見ApoE基因型，分別為E2/E3（42例，占19.8%）、E2/E4（5例，占2.4%）、E3/E3（107例，占50.5%）、E3/E4（58例，占27.3%）；3種等位基因，分別為E2（47個，占11.1%）、E3（314個，占74.1%）和E4（63個，占14.8%）。

2.2 兩組ApoE基因型、等位基因頻率比較 病例組ApoE E2/E3基因型頻率及ApoE E2等位基因頻率低于對照組，ApoE E3/E4基因型頻率及ApoE E4等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組ApoE E2/E4、E3/E3基因型頻率及ApoE E3等位基因頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.3 兩組血脂指標比較 兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB比較，差異均無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.4 病例組不同ApoE基因型患者血脂指標比較 病例組不同ApoE基因型患者TC、LDL-C、ApoB比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；病例組不同ApoE基因型患者TG、HDL-C、ApoA1比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。病例組ApoE E3/E4基因型患者TC、LDL-C、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4、E3/E3基因型患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.5 對照組不同ApoE基因型患者血脂指標比較 對照組不同ApoE基因型患者TC、LDL-C、ApoB比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組不同ApoE基因型患者TG、HDL-C、ApoA1比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組ApoE E3/E3基因型患者TC、LDL-C、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4基因型患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組ApoE E3/E4基因型患者TC、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4基因型患者，LDL-C高于ApoE E2/E3基因型患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

表1 兩組ApoE基因型、等位基因頻率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of APOE genotype and allele frequency between the two groups

表2 兩組血脂指標比較（±s）Table 2 Comparison of blood lipid indexes between the two groups

表2 兩組血脂指標比較（±s）Table 2 Comparison of blood lipid indexes between the two groups

注：TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，ApoA1=載脂蛋白A1，ApoB=載脂蛋白B

組別 例數 TC（mmol/L） TG（mmol/L） HDL-C（mmol/L） LDL-C（mmol/L） ApoA1（g/L） ApoB（g/L）對照組 98 4.80±1.26 1.96±1.32 1.22±0.36 2.76±0.97 1.03±0.27 0.88±0.24病例組 114 4.83±1.49 1.89±1.37 1.16±0.28 2.79±1.13 1.02±0.21 0.90±0.31 t值 0.192 -0.401 -1.395 0.260 -0.271 0.548 P值 0.848 0.689 0.165 0.795 0.786 0.584

2.6 T2DM患者發生腦血管并發癥的影響因素分析以T2DM患者是否發生腦血管并發癥為因變量（賦值：發生=1，未發生=0），ApoE基因型（賦值：E2/E3=1，E2/E4=2，E3/E3=3，E3/E4=4）、TC（賦值：實測值）、TG（賦值：實測值）、HDL-C（賦值：實測值）、LDL-C（賦值：實測值）、ApoA1（賦值：實測值）、ApoB（賦值：實測值）為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，ApoE基因型〔E2/E3：β=-1.741，SE=0.504，Wald χ2=11.942，P=0.001，OR=0.175，95%CI（0.065，0.471）；E2/E4：β=-2.911，SE=1.208，Wald χ2=5.809，P=0.016，OR=0.054，95%CI（0.005，0581）；E3/E3：β=-1.132，SE=0.387，Wald χ2=8.560，P=0.003，OR=0.323，95%CI（0.151，0.688）〕是T2DM患者發生腦血管并發癥的影響因素。

3 討論

T2DM合并慢性并發癥是糖尿病患者致死和致殘的主要原因。大血管并發癥是T2DM患者最為常見的慢性并發癥［6］。糖尿病大血管病變指心血管、腦血管及外周血管病變，其主要病因是動脈粥樣硬化。血脂或脂蛋白異常可促進動脈粥樣硬化及血管并發癥的發生、發展，而ApoE是血漿脂蛋白的重要成分。研究表明，體內血脂水平與ApoE基因多態性具有相關性［7-8］。此外，已有研究證實，ApoE基因型是動脈粥樣硬化的影響因素［9］。ApoE基因型的差異與個體發病的差異有關。因此，近年來ApoE基因多態性與腦血管病變關系的研究已引起更多學者的關注，但從基因表型角度探討T2DM合并腦血管并發癥影響因素的研究尚不多見。本研究分析T2DM合并腦卒中患者的ApoE基因型，并探討ApoE基因多態性與T2DM患者腦血管并發癥的關系。

ApoE可通過多種方式調節機體的脂質代謝［10］。ApoE基因最常見的等位基因是E2、E3、E4，人群中存在6種不同的ApoE基因型：E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4，其中E3/E3是最常見的基因型。ApoE基因多態性雖符合遺傳學定律，但存在一定的種族和地域差異。研究發現，不同ApoE基因型的個體，其腦血管疾病患病率存在差異［11］。本研究結果顯示，病例組ApoE E3/E4基因型頻率及ApoE E4等位基因頻率高于對照組，提示攜帶E4等位基因的T2DM患者腦血管并發癥的發生風險較高，與朱嫦琳等［11］研究結果接近，但與王雪梅等［12］研究結果不一致。筆者分析，可能與本研究納入患者的遺傳異質性、種族和地域差異等因素有關。

研究發現，ApoE E4等位基因是T2DM和冠心病的獨立危險因素［13］。研究認為，ApoE E4等位基因是腦梗死的遺傳標志［14］。也有研究認為，ApoE E3/E3基因型和ApoE E3/E4基因型在中國男性而非女性中對腦梗死具有保護作用［15］。但ApoE基因型與腦梗死的相關性仍無業內共識。目前已知ApoE基因可通過多種途徑調節脂質代謝，推測這一途徑可能影響腦血管疾病的發生和發展。本研究結果顯示，病例組ApoE E2/E3基因型頻率低于對照組，ApoE E3/E4基因型頻率高于對照組；病例組ApoE E3/E4基因型患者TC、LDL-C、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4、E3/E3基因型患者；對照組ApoE E3/E3基因型患者TC、LDL-C、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4基因型患者；提示T2DM患者發生腦血管疾病的機制可能與ApoE基因影響脂質代謝有關［16-17］。對照組ApoE E3/E4基因型患者TC、ApoB高于ApoE E2/E3、E2/E4基因型患者，LDL-C高于ApoE E2/E3基因型患者；提示對于不同ApoE基因型的T2DM患者，不論是否合并腦血管并發癥，其血脂指標TC、LDL-C、ApoB均異常。由此推測，ApoE基因多態性與血脂指標TC、LDL-C、ApoB可能存在一定關聯。病例組ApoE E2等位基因頻率低于對照組，ApoE E4等位基因頻率高于對照組，由此推測，等位基因E2可能通過調節血脂代謝而降低TC、LDL-C、ApoB，從而起到保護腦血管的作用；而攜帶E4等位基因的患者則容易發生腦血管并發癥。動脈粥樣硬化是影響腦血管疾病的重要危險因素，而LDL-C是動脈粥樣硬化發生和發展的關鍵影響因素［18］。本研究結果顯示，ApoE E2/E3〔OR=0.175，95%CI（0.065，0.471）〕、E2/E4〔OR=0.054，95%CI（0.005，0581）〕、E3/E3〔OR=0.323，95%CI（0.151，0.688）〕基因型是T2DM患者發生腦血管并發癥的保護因素，推測ApoE E3/E4基因型可能影響TC、LDL-C、ApoB水平，進而加速斑塊形成和促進動脈粥樣硬化的發展［19-20］。

表3 病例組不同ApoE基因型患者血脂指標比較（±s）Table 3 Comparison of blood lipid indexes of patients with different ApoE genotypes in case group

表3 病例組不同ApoE基因型患者血脂指標比較（±s）Table 3 Comparison of blood lipid indexes of patients with different ApoE genotypes in case group

注：與ApoE E2/E3基因型比較，aP＜0.05；與ApoE E2/E4基因型比較，bP＜0.05；與ApoE E3/E3基因型比較，cP＜0.05

ApoE基因型 例數 TC（mmol/L） TG（mmol/L） HDL-C（mmol/L） LDL-C（mmol/L） ApoA1（g/L） ApoB（g/L）E2/E3 15 4.51±1.59 2.07±0.85 1.17±0.22 2.51±1.22 0.97±0.27 0.77±0.29 E2/E4 1 2.80±0.00 1.39±0.00 0.84±0.00 1.31±0.00 0.76±0.00 0.59±0.00 E3/E3 55 4.25±1.19 1.75±1.69 1.17±0.32 2.34±0.98 1.01±0.18 0.81±0.34 E3/E4 43 5.74±1.39abc 2.00±1.06 1.15±0.26 3.51±0.92abc 1.05±0.20 1.06±0.20abc F值 11.326 0.403 0.465 12.487 1.257 7.406 P值 ＜0.001 0.751 0.708 ＜0.001 0.293 ＜0.001

表4 對照組不同ApoE基因型患者血脂指標比較（±s）Table 4 Comparison of blood lipid indexes of patients with different ApoE genotypes in control group

表4 對照組不同ApoE基因型患者血脂指標比較（±s）Table 4 Comparison of blood lipid indexes of patients with different ApoE genotypes in control group

注：與ApoE E2/E3基因型比較，aP＜0.05；與ApoE E2/E4基因型比較，bP＜0.05

ApoE基因型 例數 TC（mmol/L） TG（mmol/L） HDL-C（mmol/L） LDL-C（mmol/L） ApoA1（g/L） ApoB（g/L）E2/E3 27 4.09±0.85 2.18±0.78 1.23±0.37 2.28±0.76 0.99±0.28 0.78±0.23 E2/E4 4 3.41±1.07 0.73±0.15 1.29±0.21 1.67±0.74 0.96±0.16 0.58±0.15 E3/E3 52 5.11±1.30ab 1.94±1.60 1.22±0.37 2.99±1.01ab 1.03±0.26 0.91±0.23ab E3/E4 15 5.35±1.02ab 1.99±1.03 1.21±0.37 3.09±0.72a 1.10±0.28 0.99±0.19ab F值 7.865 1.427 0.059 6.302 0.677 5.848 P值 ＜0.001 0.240 0.981 0.001 0.568 0.001

本研究尚存在一定局限性，如入選患者均屬于同一地區和同一種族，樣本量較小等，在后續研究中，可開展多地區、多種族、大樣本量的研究，并納入更多的疾病種類進行廣泛深入的研究，從而更進一步地探討ApoE基因多態性對T2DM患者并發腦血管并發癥的影響及應采取的防治措施。

綜上所述，ApoE基因型是T2DM患者發生腦血管并發癥的影響因素，其中具有ApoE E3/E4基因型的T2DM患者發生腦血管并發癥的風險增加，其機制可能與ApoE基因型影響TC、LDL-C、ApoB水平有關。

作者貢獻：李偉進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理；孔璐璐進行研究的實施與可行性分析；高銀婷進行數據收集與整理、統計學處理，撰寫論文；高銀婷、孔璐璐進行結果的分析與解釋、論文的修訂、英文的修訂。

本文無利益沖突。