冠心病血瘀證形成過程中心肌細胞能量代謝酶作用及其機制研究

周曼麗，俞赟豐，馮宇，簡維雄，2

本文創(chuàng)新點：

冠心病血瘀證是一個“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動的過程，心肌細胞能量代謝貫穿始終，而以往對能量代謝的研究局限于病程中的某個階段，本研究通過構建冠心病血瘀證形成過程的動物模型模擬冠心病血瘀證形成的過程，進而研究能量代謝酶的變化。結果顯示，心肌細胞能量代謝酶參與冠心病血瘀證形成的整個過程；參與代謝相關的酶類中三磷酸腺苷（ATP）與一磷酸腺苷（AMP）水平變化最為關鍵，這將是腺苷活化蛋白激酶（AMPK）通路發(fā)揮應激性心肌保護作用的重要信號，同時AMPK通路的激活很可能是觸發(fā)心肌細胞能量代謝其他酶類變化的上游效應分子。這對血瘀證狀態(tài)下冠心病心肌細胞代謝機制的探索以及揭示心肌損傷修復和治療機制具有重要的意義。

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）指冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病。我國心血管疾病的發(fā)病率逐年上升，盡管人們采取了各種現代化治療方法，如靜脈溶栓、心臟介入治療等，其發(fā)病率和死亡率仍居各類致死性疾病前列［1］。中醫(yī)古籍中并無冠心病之稱，其當屬中醫(yī)胸痹真心痛的范疇。胸痹病機雖有血瘀、痰阻、寒凝、氣滯之別，但基本的病機是心脈不通，而血瘀證是冠心病中最常見的證型之一。中醫(yī)學認為證不是靜止不變而是動態(tài)演變的，具有由輕及重的流動性特點。冠心病血瘀證是一個“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動的過程［2］。能量代謝是疾病的一種反應形式，病情在變化，能量自然也在變［3］。心臟利用能量的形式是三磷酸腺苷（ATP），而ATP來源于心臟對脂肪酸、糖類、乳酸、丙酮酸及酮體等多種供能物質的代謝。能量代謝障礙是眾多急/慢性病變共同的病理生理基礎［4］，能量代謝過程中不同蛋白酶水平差異對于疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。本文旨在分析冠心病血瘀證心肌細胞能量代謝酶活性機制，以進一步了解疾病發(fā)生背后的分子機制，進而為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠共30只，體質量（230±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心實驗動物中心提供。大鼠常規(guī)飼料和高脂飼料均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。大鼠在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度22～26 ℃，濕度50%～70%，3只/籠，定量給予常規(guī)飼料或高脂飼料，自由飲水。

1.2 實驗藥物與試劑 維生素D3粉劑（購自湖北楚米生物科技有限公司，規(guī)格：10萬U/G，批號：2018012202）；異丙腎上腺素（購自美國Sigma公司，規(guī)格：1 g，CAS號：51-30-9）；ATP試劑盒（貨號：ml460314）、一磷酸腺苷（AMP）試劑盒（貨號：ml460319）、Na+-K+-ATP酶（貨號：ml058954）、Ca2+-Mg2+-ATP酶試劑盒（貨號：ml059467）、酯酰輔酶A合成酶（acyl-coenzyme A synthetase，ACS）試劑盒（貨號：ml003386）、肉毒堿脂酰轉移酶（carnitine acyl transferase，CACT）試劑盒（貨號：ml003383）（規(guī)格均為48 T，均購自上海酶聯生物科技有限公司）；2.5%戊二醛電鏡固定液（購自北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1126）；組織固定液（購自武漢賽維爾生物科技公司，貨號：G1101）。

1.3 實驗儀器 MICRO17離心機（購自美國Thermo公司）；chemray240全自動生化儀（購自深圳雷杜生命科技有限公司）；RT-6100酶標分析儀（購自美國Rayto公司）；HT7700透射電子顯微鏡（購自日本HITACHI公司）；Leica UC7超薄切片機（購自德國Leica公司）；美國BIOPAC多導（16道）生理記錄儀（MP150）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗時間 本實驗時間為2019年10—12月。

1.4.2 動物分組及造模 30只大鼠采用常規(guī)飼料適應性喂養(yǎng)7 d后，采用簡單隨機抽樣法分為空白對照組6只（A組）和模型大鼠24只。A組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，模型大鼠高脂飼料喂養(yǎng)7 d后進行維生素D3灌胃（30萬U/kg），4 d后再予以維生素D3灌胃（20萬U/kg），繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)21 d后，死亡4只大鼠，從剩余20只大鼠中隨機選擇6只為血瘀證前期組（B組），并采血取材；剩余14只大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)30 d后死亡2只，從剩余12只大鼠中隨機選擇6只為亞血瘀證期組（C組），并采血取材；余6只大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)的同時予以皮下多點注射異丙腎上腺素（5 mg/kg），連續(xù)注射3 d，1周后記錄標準Ⅱ導聯心電圖，以ST段出現上抬或明顯壓低（≥0.1 mV）確定成模［5］，為血瘀證期組（D組），并采血取材。

1.4.3 標本采集 為保證各指標檢測的一致性，每組選取6只大鼠。大鼠麻醉后進行腹主動脈采血，截取一段腹主動脈放入組織固定液中以備行HE染色。開胸取心臟，取材時要快且避免牽拉傷。大鼠心臟分為3份，一份投入2.5%戊二醛固定液中4 ℃避光固定用于電鏡檢測；一份投入組織固定液中用于心肌HE染色；另一份投入-80 ℃冰箱中保存用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

1.4.4 觀察指標

1.4.4.1 一般情況 觀察各組大鼠一般情況，包括大鼠反應、活動度、精神、皮毛、體質量、爪甲等。

1.4.4.2 血脂指標 使用chemray240全自動生化儀檢測各組大鼠血脂指標，包括總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.4.4.3 腹主動脈及心肌組織HE染色結果 將腹主動脈及心肌組織放入多聚甲醛液中固定；將組織塊放入包埋盒中修剪，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明浸蠟，將已透明的組織塊放入溶蠟箱保溫，待組織塊變硬開始切片；將切下的薄片放在45 ℃恒溫箱中烘干；二甲苯脫蠟，經梯度乙醇溶液脫水，倒入蒸餾水，進行HE染色。觀察各組大鼠腹主動脈內、中、外膜結構及彈性纖維層情況。

1.4.4.4 心電圖 記錄各組大鼠心電圖檢查結果。

1.4.4.5 線粒體超微結構 采用HT7700透射電子顯微鏡觀察各組大鼠線粒體形態(tài)、大小、嵴結構等。

1.4.4.6 心肌組織能量代謝酶水平 采用ELISA檢測四組大鼠心肌組織能量代謝酶（ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT）水平。

1.5 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時采用LSD（L）法，組間兩兩比較方差不齊時采用Tamhane's T2（M）法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠一般情況 A組大鼠活動自如，反應靈敏，皮毛光亮；B組大鼠體質量減輕，反應漸遲鈍，精神倦怠，毛色枯槁無光澤；C組大鼠體質量明顯減輕，精神萎靡，蜷縮相擁，活動量少；D組大鼠精神欠佳，易驚，觸之狂躁，毛色枯槁無光澤，爪甲紫暗。

2.2 四組大鼠血脂指標比較 四組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。B組大鼠TC、LDL-C、HDL-C水平高于A組，TG水平低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組大鼠TC、LDL-C、HDL-C水平高于A、B組，TG水平低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組大鼠HDL-C水平低于A、B、C組，TC、LDL-C水平低于B、C組，TG水平高于B、C組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 四組大鼠腹主動脈及心肌組織HE染色結果 大鼠腹主動脈HE染色結果：A組大鼠動脈內、中、外膜結構完整，層次分明，彈性纖維層結構基本清晰；B組大鼠動脈內膜出現損傷，內皮細胞腫脹，內膜下及中膜出現明顯鈣化現象，彈性纖維層被破壞；C組大鼠動脈中膜完全鈣化，中膜斑塊脫落導致典型的空腔結構；D組大鼠動脈內膜結構破壞，內彈性膜崩解斷裂，內、中、外膜三層結構不清晰（見圖1）。大鼠心肌組織HE染色結果：A組大鼠心肌纖維排列整齊規(guī)律，心肌細胞形態(tài)規(guī)則完整，細胞核清晰居中；B、C、D組大鼠心肌纖維萎縮斷裂，胞質呈不規(guī)則粗顆粒狀，心肌間質水腫，膠原纖維增生（見圖2，高清彩圖詳見本文OSID碼）。

2.4 四組大鼠心電圖 A組大鼠心電圖正常（見圖3a）；B組大鼠心電圖示P波規(guī)律出現，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，無寬大畸形（見圖3b）；C組大鼠心電圖示竇性心律，P波規(guī)律出現，P-R間期及R-R間期大致相同，QRS波波形規(guī)律，J點無明顯改變（見圖3c）；D組大鼠心電圖未見明顯P波，R-R間期大致相同，ST段明顯壓低，T波低平（＞0.1 mV）（見圖3d）。

表1 四組大鼠血脂指標比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of blood lipid indexes in four groups

表1 四組大鼠血脂指標比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of blood lipid indexes in four groups

注：A組為空白對照組，B組為血瘀證前期組，C組為亞血瘀證期組，D組為血瘀證期組；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05；TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇

組別 TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）A 組 1.61±0.22 1.86±0.89 0.25±0.09 1.25±0.23 B 組 3.95±0.92a 0.57±0.86a 2.82±0.87a 1.58±0.25a C組 6.78±1.58ab 0.58±0.22a 5.36±1.59ab 2.01±0.27ab D組 1.45±0.13bc 1.56±0.57bc 0.43±0.10bc 1.09±0.16abc F值 66.317 12.241 23.436 61.878 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 四組大鼠腹主動脈HE染色結果（×20）Figure 1 Results of HE staining of abdominal aorta of rats in four groups

圖2 四組大鼠心肌組織HE染色結果（×200）Figure 2 Results of HE staining in myocardial tissue of rats in four groups

2.5 四組大鼠線粒體超微結構 A組大鼠線粒體嵴結構清晰、完整；B組大鼠線粒體腫脹，部分線粒體嵴結構出現溶解；C組大鼠線粒體嵴結構大部分出現溶解、空泡形成，線粒體出現明顯移位、濃縮；D組大鼠線粒體排列紊亂、多數線粒體嵴結構斷裂甚至模糊不清（見圖4）。

圖3 四組大鼠心電圖檢查結果Figure 3 Results of ECG examination of rats in four groups

2.6 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較 四組大鼠心肌 組 織 ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。B組大鼠心肌組織AMP、Ca2+-Mg2+-ATP酶、ACS、CACT水平低于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組大鼠心肌組織ATP、AMP、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組，ATP水平低于B組，ACS水平高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組大鼠心肌組織ATP、Na+-K+-ATP酶水平低于A、B組，AMP、ACS水平高于B組，ATP水平低于C組，AMP、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of energy metabolizing enzyme levels in myocardial tissue of rats in four groups

表2 四組大鼠心肌組織能量代謝酶水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of energy metabolizing enzyme levels in myocardial tissue of rats in four groups

注：ATP=三磷酸腺苷，AMP=一磷酸腺苷，ACS=酯酰輔酶A合成酶，CACT=肉毒堿脂酰轉移酶；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別 ATP AMP Na+-K+-ATP酶 Ca2+-Mg2+-ATP酶 ACS CACT A 組 810.8±49.7 171.9±5.8 509.2±23.2 181.1±14.0 164.9±14.9 136.7±12.0 B組 772.4±35.5 129.9±8.1a 496.0±39.6 144.3±10.7a 135.2±7.3a 114.6±6.1a C組 684.7±87.3ab141.4±14.3a 371.5±81.7a 140.4±32.5a183.7±29.1b123.6±12.2 D 組 602.5±66.8abc168.8±8.3bc 412.3±25.2ab 163.6±8.2c 177.0±6.0b 125.7±8.2 F值 18.676 27.317 11.200 5.928 9.530 4.999 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.002 0.005 0.004 0.012

圖4 四組大鼠線粒體超微結構（×5 000）Figure 4 Mitochondrial ultrastructure of rats in four groups

3 討論

本研究通過構建冠心病血瘀證形成過程的動物模型模擬冠心病血瘀證形成的過程，進而研究能量代謝酶的變化，這對血瘀證狀態(tài)下冠心病心肌細胞代謝機制的探索以及揭示心肌損傷修復和治療機制具有重要的意義。

3.1 冠心病血瘀證形成過程中腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）參與調控的能量代謝過程線粒體是細胞的供能中心，當機體內能量代謝發(fā)生紊亂時，ATP水平最先受到影響。AMPK被稱為細胞能量感受器，其活性主要受AMP/ATP調節(jié)。在低氧、缺血等條件下，細胞內AMP/ATP升高，AMPK易被激活［6］。本研究結果顯示，C、D組大鼠心肌組織ATP水平低于A、B組，D組大鼠心肌組織ATP水平低于C組；B、C組大鼠心肌組織AMP水平低于A組，D組大鼠心肌組織AMP水平高于B、C組；提示機體內AMP/ATP比例失調會誘發(fā)AMPK的激活。AMPK屬于異源三聚體，由α、β、γ 3個亞基組成［7-8］。大量研究發(fā)現，AMPK的下游靶蛋白主要與能量代謝調節(jié)有關，其通過調控代謝相關酶而幫助細胞度過急性損傷期，暫時保障細胞的存活［9-12］。AMPK參與機體能量代謝可以用“開源”“節(jié)流”四個字來概括，具體表現在糖代謝、脂肪酸代謝、蛋白質代謝以及線粒體的生物合成和自噬等方面。心臟能源底物的利用隨機體生理或病理狀態(tài)的不同處于動態(tài)變化中［13］。心肌輕度及中度缺血時，心肌能量利用的形式主要是糖酵解，同時脂肪酸的氧化也會加速［14］；激活的AMPK能夠使更多的葡萄糖轉運蛋白（GLUT）4易位至肌膜，隨后增加心肌細胞對葡萄糖的攝入［15-17］。同時AMPK還可以激活糖酵解的關鍵酶6-磷酸果糖激酶2（PFK2），提高糖酵解的效率，進而快速為心肌補償供能［18］。當缺血時間過長或嚴重缺血時，GLUT的轉移過程受到抑制，葡萄糖攝取減少或中斷，糖原儲存耗竭，另一方面糖酵解產生的丙酮酸不能徹底被有氧氧化而致乳酸堆積，導致細胞內酸中毒，心肌細胞受損明顯［14，19］。AMPK的激活被證明可以增加脂肪酸轉運體CD36的轉位，從而增加心臟中脂肪酸的利用率［20-21］。AMPK促進脂蛋白脂酶（LPL）從胞質轉運到血管內皮細胞，在血管內皮細胞中催化TG轉化為脂肪酸［7］。此外，AMPK-乙酰輔酶A羧化酶（ACC）信號通路在脂質代謝過程中發(fā)揮著至關重要的作用［22］。激活的AMPK可磷酸化ACC，減少丙二酰輔酶A合成，增加肉堿棕櫚酰轉移酶1（CPT1）的活性，促進長鏈酯酰輔酶A從胞質進入線粒體進而催化脂肪酸β-氧化［23-25］，此時會增加脂肪酸氧化和ATP產生的速率，故可以滿足心肌的暫時需求。活化的AMPK可直接磷酸化過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔活化子1-α（PGC-1α）或與去乙酰化酶（SIRT1）調控PGC-1α活性［26-27］，進而促進糖酵解和線粒體的生物合成［28］，并抑制活性氧（ROS）的產生以及線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放，起到保護線粒體的生物學功能的作用［29］。此外，KIM等［30］研究表明，AMPK和PGC-1α的升高可以抑制核轉錄因子κB（NF-κB）的活性和腫瘤壞死因子（TNF）-α在人主動脈平滑肌細胞和內皮細胞表達，進而促進炎癥的分解［31］。SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine nucleotides，NAD+）依賴的組蛋白去乙酰化酶，通過降低其底物叉頭轉錄因子（forkhead box transcription factor O，FOXO）乙酰化水平而激活Bcl-2和生存素，抑制促凋亡因子Bax和Caspase-3，最終減輕心肌缺血性損傷［32-33］。心肌組織的纖維化改變是心肌組織缺血缺氧后發(fā)生重構的典型病理改變。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）已經被公認為是蛋白質合成的中心調解分子，并且其活性被AMPK調控，AMPK通過磷酸化TSC2抑制下游GTP酶Rheb進而調控mTOR抑制蛋白質合成［34-35］，這有利于減少缺血性損傷后心肌肥厚的發(fā)生。與此同時，蛋白質的合成也受控于AMPK磷酸化真核延伸因子2激酶（eEF2k）的能力，使真核延伸因子2（eEF2）磷酸化并使其失活［36-37］。在下調蛋白質合成的同時，AMPK還通過直接抑制糖原合成酶和甘油磷酸酰基轉移酶（GPAT）來抑制糖原和TG的產生，避免應激狀態(tài)下的多余耗能［38］。過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）γ是核激素受體超家族中的一員，位于AMPK/mTOR信號通路上，一般參與細胞生長、蛋白質合成以及炎性因子的表達［39-40］。有研究發(fā)現，高脂飲食大鼠血管內皮損傷模型中PPARγ具有明顯減輕氧化應激反應、延緩動脈粥樣硬化的作用［41］。由于AMPK對mTOR信號的調節(jié)作用，AMPK也與自噬相關。心肌細胞自噬通過降解功能異常受損或老化的細胞器，為細胞提供能量、促進物質循環(huán)以及細胞的自我更新，以維持心臟功能和細胞存活［42］。在局部缺血過程中，AMPK抑制mTOR也可以通過磷酸化ULK激酶（ULK1，一種介導自噬的中心蛋白）直接觸發(fā)自噬，進而在心肌梗死時起到對心臟的保護作用［43-44］。綜上，AMPK可與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR通路發(fā)揮交互作用，并最終通過調節(jié)蛋白質合成、線粒體生物發(fā)生、心肌自噬和抗凋亡途徑而發(fā)揮心肌保護作用（見圖 5）［45］。

3.2 冠心病血瘀證能量代謝途徑中關鍵酶的分析 本研究組前期已運用“氣相色譜-質譜”的代謝組學技術對冠心病血瘀證患者血漿、尿液及模型大鼠的心肌組織、血漿的代謝產物變化進行研究，發(fā)現冠心病血瘀證形成過程中心肌能量代謝變化貫穿始終［14，46］。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶是細胞膜上一種重要糖蛋白，在信息傳遞、能量代謝、物質轉運及維持細胞器完整性等多方面發(fā)揮重要的作用，可作為細胞代謝紊亂的重要指標［47-48］。正常情況下，Na+-K+-ATP酶能夠利用ATP釋放的能量將Na+運到細胞外，同時將細胞外的K+運輸到細胞內。ATP的缺乏使Na+-K+-ATP酶活性受抑制，導致Na+滯留于細胞內，造成細胞水腫；同時細胞內Na+濃度過高會啟動Na+-Ca2+交換，細胞內Ca2+超載不僅有可能會增強心肌收縮力，引發(fā)心力衰竭，還會破壞線粒體功能，導致能量合成障礙，細胞凋亡。此外，細胞外K+濃度過高，細胞興奮性增強，可能會導致心律失常。本研究結果顯示，B組大鼠心肌組織Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組；C組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平低于A組；D組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶水平低于A、B組，Ca2+-Mg2+-ATP酶水平高于C組；表明冠心病血瘀證慢性心肌缺血模型逐步形成的過程中，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平在亞血瘀證期下降明顯，但在心血瘀阻證期Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶水平較前有所上升，這可能與心肌缺血應激狀態(tài)下AMPK通路的激活有關，AMPK通路的激活會激活促使線粒體生物發(fā)生的分子，例如PGC-1α，進而恢復心肌細胞功能。心肌缺血狀態(tài)下，AMPK激活除了調節(jié)糖代謝外，還通過調動游離脂肪酸β-氧化途徑為心肌組織緊急供能，而長鏈脂肪酸進入線粒體必須借助CACT轉運，才能形成乙酰輔酶A并經過三羧酸循環(huán)產生ATP［49］。當脂肪酸借助CACT進入線粒體內膜后，還需在催化脂肪酸活化的關鍵酶ACS幫助下進行β-氧化完成供能使命。本研究結果顯示，B組大鼠心肌組織ACS、CACT水平低于A組；C組大鼠心肌組織ACS水平高于B組；D組大鼠心肌組織ACS水平高于B組；表明血瘀證前期ACS、CACT水平有所降低，但在亞血瘀證期和血瘀證期ACS水平逐漸升高，這可能與AMPK通路激活后促使游離脂肪酸氧化增強，ACS及CACT利用度增加有關，這也與另一篇文獻報道結果［14］一致。冠心病是慢性病中的頭號殺手，本實驗對于其形成過程中能量代謝變化進行了初步探究，然而其變化背后的具體機制仍有待進一步深入挖掘，這對于慢性病的早發(fā)現、早干預具有重要的指示意義。

圖5 激活的AMPK潛在下游分子信號通路在心肌保護中的作用Figure 5 The role of activated AMPK potential downstream molecular signaling pathways in myocardial protection

3.3 本研究局限性 本研究尚存在一定局限性：（1）本研究納入樣本量相對較小，結果可能存在一定偏倚，需要在后續(xù)的研究中擴大樣本量；（2）由于課題經費有限，本研究雖進一步證實了冠心病血瘀證形成過程中心肌能量代謝酶類水平差異性改變，但沒有進行深層次的分子機制探究，這有待于在今后的實驗研究中進一步完善。

綜上所述，心肌細胞能量代謝酶參與冠心病血瘀證形成的整個過程。參與代謝相關的酶類中ATP與AMP水平變化最為關鍵，這將是AMPK通路發(fā)揮應激性心肌保護作用的重要信號，同時AMPK通路的激活很可能是觸發(fā)心肌細胞能量代謝其他酶類變化的上游效應分子。

作者貢獻：周曼麗進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析、數據收集與整理、統計學處理、結果的分析與解釋，撰寫論文；俞赟豐、馮宇進行論文的修訂、英文的修訂；簡維雄負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。