小麥水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆與表達分析

杜爽爽，張玉玲，田書軍，聞珊珊

(西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上最重要的的糧食作物之一，其產量與質量關乎世界糧食安全問題。小麥種植地區(qū)廣泛，許多種植地區(qū)存在多種逆境脅迫，對小麥的生長造成了極大地傷害，降低了小麥的產量與品質[1]。因此，培育小麥抗逆性品種是近年來研究的熱點，而增強小麥抗逆能力的關鍵性原因是提高小麥植株細胞間水分運輸的能力[2]。

水通道蛋白(aquaporin, AQP)是一類能夠在細胞膜上組成“孔道”，高效特異性轉運水分子的膜內在蛋白，分子質量為23～35ku，對于維持正常或逆境條件下植物的水分運輸具有重要作用。AQP屬于主要內在蛋白(MIP)超家族[3-5]，其種類主要可分為7個：質膜內在蛋白(PIP)、液泡膜內在蛋白(TIP)、類NOD26膜內在蛋白(NIP)、小分子堿性膜內在蛋白(SIP)、類甘油促進膜內在蛋白(GIP)、雜合內在蛋白(HIP)和X 內在蛋白(XIP)[6]。小麥中的水通道蛋白多為TIP、PIP、NIP和SIP四個家族的成員。水通道蛋白具有豐富多樣性，能夠在玉米、水稻、小麥、大麥、大豆、擬南芥等多種植物中發(fā)現其存在，目前已在31種植物中鑒定出1200多個AQP基因[7]。

水通道蛋白結構高度保守，具有6個跨膜α螺旋，保守的NPA域(天冬氨酸-蛋白質-丙氨酸)和芳香族/精氨酸選擇性孔道[8]。目前的研究中，水通道蛋白的功能從吸收和運輸水及尿素[9]、二氧化碳[10]、硼酸[11]和硅[12]等不帶電荷的小分子擴展到了其他方面，包括參與細胞間的滲透調節(jié)[13],細胞生長與分化[14],種子發(fā)芽[15]，植物的氣孔運動[10]、光合作用[16]、固氮作用[17],植物的開花與生殖生長[18]以及對干旱、鹽、低溫等多種逆境脅迫的響應[19]。

TaTIP1-1c-4BL基因屬于液泡膜內在蛋白(TIPs)家族。與其他水通道蛋白家族相比，TIP在細胞的滲透調節(jié)中發(fā)揮重要作用[13]。小麥品種‘科農199’為半冬性小麥品種，種植范圍廣，產量高，在轉基因研究中轉化效率較高(基因槍法)，是后續(xù)研究中的轉基因受體，因此本研究選擇從小麥品種‘科農199’中克隆出小麥水通道蛋白基因TaTIP1-1c-4BL并利用實時熒光定量PCR技術分析TaTIP1-1c-4BL在小麥不同組織部位以及不同逆境脅迫下該基因在小麥灌漿期葉片中的表達模式，通過生物信息學分析TaTIP1-1c-4BL蛋白的理化性質、結構及系統(tǒng)發(fā)育關系。以期進一步了解TaTIP1-1c-4BL基因的抗逆調控機制，為后續(xù)研究中培育小麥抗逆性品種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為小麥品種‘科農199’，將小麥種子置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量的蒸餾水，在人工氣候箱(溫度25 ℃，光暗比16 h/8 h，相對濕度60%)中催芽2 d后,選取發(fā)芽勢一致的小麥種子，移入添加有營養(yǎng)土(基 質∶蛭石= 3∶1)的小盆中，置于人工氣候箱培養(yǎng)5 d,期間每天澆1次Hoagland’s (霍格蘭氏)營養(yǎng)液，最后放入春化柜(4 ℃)中春化25 d，期間每5 d澆1次Hoagland’s營養(yǎng)液。春化結束后將小麥植株移栽入大花盆中，置于西北農林科技大學科研溫室(溫度22～28 ℃，光暗比16 h/8 h)中培養(yǎng)至灌漿期。

1.2 方 法

1.2.1 試驗材料的處理 取灌漿期小麥植株的根、莖、葉、籽粒和穎殼等組織，用于分析TaTIP1-1c-4BL基因在小麥各組織中的基因表達。參考黃超[20]、劉燕等[21]的處理方法，在灌漿期(開花后15 d)選取長勢一致的小麥植株進行脫落酸脅迫(ABA，100 μmol/L)、過氧化氫脅迫(H2O2,10 mmol/L)、干旱脅迫(PEG-6000，20%)和鹽脅迫(NaCl，200 mmol/L)。在 0 h、 2 h、6 h、8 h、 12 h、24 h時取小麥葉片，立即放入液氮中，于 -80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 小麥總RNA提取及 cDNA合成 采用 Trizol法提取‘科農199’不同組織及不同脅迫處理后樣品的總RNA。Trizol試劑來自生工生物工程(上海)股份有限公司。使用羅氏反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，取一部分cDNA 母液稀釋至200 ng/μL，保存于4 ℃冰箱，備用，未稀釋母液保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 小麥TaTIP1-1c-4BL基因的克隆 在Ensemble plant 數據庫( http: //plants．ensembl．org /index．html)中進行搜索獲得TaTIP1-1c基因(登錄號G310900)3條拷貝的cDNA序列，3條拷貝分別位于小麥4AL，4BL,4DL染色體上。在wheat expression數據庫(https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)中可查詢TaTIP1-1c-4AL，TaTIP1-1c-4BL和TaTIP1-1c-4DL在小麥各個組織部位的表達量，其中TaTIP1-1c-4BL在小麥各個組織部位的表達量均遠高于TaTIP1-1c-4AL和TaTIP1-1c-4DL，因此后續(xù)轉基因研究中將利用TaTIP1-1c-4BL基因構建表達載體，因此本研究主要針對TaTIP1-1c-4BL進行。利用Primer 5.0 軟件設計TaTIP1-1c-4BL基因的特異性引物(表1，KL-F和KL-R)。引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。以小麥‘科農199’的cDNA為模板，使用高保真酶KOD Plus (TOYOBO,上海根生生物有限公司)進行PCR擴增，反應體系如下：KOD Plus酶(1.0 U/μL)0.4 μL，10×PCR Buffer for KOD Plus 2 μL，dNTPs (2 mmol/L) 2 μL，MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL，正、反向引物 (5 μmol/L)各1 μL，cDNA(200 ng/μL)1 μL，ddH2O 11.8 μL。反應程序參考高保真酶KOD Plus (TOYOBO,上海根生生物有限公司)使用說明書。PCR反應產物使用10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將含有目的片段的瓊脂糖凝膠使用柱式瓊脂糖凝膠回收試劑盒(生工，上海)進行膠回收，膠回收產物使用GenStar的Taq DNA Polymerase(5 U/μL)加A尾,將加A尾后的目的片段連接至pUCM-T Vector載體(生工，上海)并轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(生工，上海)中，經藍白斑篩選后挑取陽性單克隆搖菌并提取質粒，經鑒定后送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。測序結果使用NCBI(https://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)網站進行序列比對。

1.2.4 小麥TaTIP1-1c-4BL基因的生物信息學分析 TaTIP1-1c-4BL蛋白的特性分析使用ExPASy-ProtParam( https: //web．expasy．org /protparam/) ；TaTIP1-1c-4BL蛋白的跨膜域預測使用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )；TaTIP1-1c-4BL蛋白的信號肽分析使用SignalP-5.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services /SignalP/)；TaTIP1-1c-4BL蛋白的二級結構分析使用SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)；建立TaTIP1-1c-4BL蛋白的三級結構模型使用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/ interac -tive)；TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)的順式作用原件分析使用Plantcare(http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/ plantcare/html/)；使用MEGA 7.0 軟件(鄰接法，bootstrap 值設為1 000)構建TaTIP1-1c-4BL蛋白的系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 小麥TaTIP1-1c-4BL基因的表達模式分析 使用Primer 5.0 軟件和Primer-Blast在線工具設計TaTIP1-1c-4BL基因的qRT-PCR特異性引物(Q-F和Q-R)，內參基因使用小麥β-actin基因，使用熒光定量PCR儀Roche LightCycler 480和UltraSYBR Mixture 試劑(康為世紀)進行qRT-PCR擴增，設置3個生物學重復與3個技術性重復。反應體系和反應程序(兩步法)參考UltraSYBR Mixture(康為世紀)使用說明書。TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量使用2-△△Ct法[22]計算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.6 數據分析及圖表處理 使用Excel 2010 軟件和Photo shop軟件對數據進行分析、處理以及圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 TaTIP1-1c-4BL基因的克隆

通過對‘KN199’cDNA的PCR擴增和對PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長約814 bp的目的條帶，測序結果在NCBI網站上進行序列比對。結果表明該序列與TaTIP1-1c-4BL基因完全匹配，證明克隆出了TaTIP1-1c-4BL基因。

2.2 TaTIP1-1c-4BL蛋白理化性質的分析

TaTIP1-1c-4BL基因序列全長1 237 bp，編碼區(qū)長度為753 bp，共編碼250個氨基酸。蛋白特性分析結果為：TaTIP1-1c-4BL蛋白的分子量為25 755.92 u，水通道蛋白的分子質量在23 ku至35 ku，因此TaTIP1-1c-4BL蛋白屬于分子質量較小的水通道蛋白。脂肪指數為108.52。理論等電點為6.04，理論等電點略小于7，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白為弱酸性蛋白。不穩(wěn)定系數為 20.72，不穩(wěn)定系數小于40，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白穩(wěn)定性較好。親水性平均值為0.809，親水性大于0，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白為疏水性蛋白。

M.分子質量標準

2.3 TaTIP1-1c-4BL蛋白的跨膜域、信號肽分析

跨膜域分析(圖 2)顯示TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6個跨膜域，是典型的水通道蛋白跨膜結構，大多數水通道蛋白均具有6個跨膜域，跨膜域分析結果證明TaTIP1-1c-4BL蛋白是跨膜蛋白。信號肽分析結果顯示TaTIP1-1c-4BL蛋白無信號肽，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白不屬于分泌蛋白。

2.4 TaTIP1-1c-4BL蛋白的二級結構及三級結構分析

TaTIP1-1c-4BL蛋白的二級結構分析結果顯示該蛋白具有26.8%的α螺旋，25.6%的延伸直鏈和 47.6%的不規(guī)則卷曲(圖3)。TaTIP1-1c-4BL蛋白的三級結構分析結果(圖4)顯示該蛋白由4個單體形成同源四聚體的形式存在，整體呈“水漏”狀，這種結構對保持水通道蛋白結構的穩(wěn)定以及準確發(fā)揮其功能具有重要作用。每個單體由5個短環(huán)相連接的6個跨膜α螺旋構成，且每個單體中間的孔道相互獨立，互不干擾，可供水及其他不帶電荷的小分子通過，無配體存在。TaTIP1-1c-4BL蛋白的三級結構與數據庫中水通道蛋白TaTIP2-1的三級結構模型相似度達到62.60%，這表明TaTIP1-1c蛋白與TaTIP2-1蛋白在功能上可能有部分相似。

2.5 TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)順式作用元件的分析

從NCBI數據庫中獲取TaTIP1-1c-4BL基因起始密碼子上游2kb的核苷酸序列，預測分析TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)可能含有的順式作用元件。預測結果(表2)顯示TaTIP1-1c-4BL基因的啟動子區(qū)具有脫落酸響應元件(ABRE)、生長素響應元件(TGA-element)、茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif，TGACG-motif)等激素響應元件，推測TaTIP1-1c-4BL基因的表達可能受到脫落酸、生長素、茉莉酸甲酯等激素的調控；TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)也含有光響應元件(G-box，Sp1)和低溫響應元件(LTR)，這表明光照和低溫可能影響TaTIP1-1c-4BL基因的表達；此外TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)含有其他順式作用元件，如啟動子和增強子區(qū)元件(CAAT-Box，TATA-box)，參與缺氧特異性誘導的類增強子(GC-motif)，參與胚乳表達的順式調控元件(GCN4-motif)等。對TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)可能含有的順式作用元件預測分析結果為進一步了解該基因的功能奠定基礎。

圖2 TaTIP1-1c-4BL蛋白的跨膜域分析Fig.2 Transmembrane domains of TaTIP1-1c-4BL

藍、紅、粉色豎線分別代表α-螺旋、延伸直鏈和無規(guī)則卷曲

圖4 TaTIP1-1c-4BL蛋白的三級結構模型Fig.4 Tertiary structure prediction of TaTIP1-1c-4BL protein

2.6 TaTIP1-1c-4BL蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

從NCBI網站上查詢與TaTIP1-1c-4BL蛋白相似的蛋白氨基酸序列，選擇來自不同禾本科植物的蛋白氨基酸序列構建TaTIP1-1c-4BL蛋白的系統(tǒng)進化樹 ，系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示TaTIP1-1c-4BL蛋白與來自粗山羊草(Aegilopstauschii)和大麥(Hordeumvulgare)中的水通道蛋白序列相似性較高，出現該現象的原因可能與粗山羊草、大麥與小麥‘KN199’的親緣關系較近有關，其中粗山羊草是普通小麥D基因組的供體。TaTIP1-1c-4BL蛋白與來自絲穎針茅(Stipacapillacea)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum)、珍珠粟(Cenchrusamericanus)、谷子(Setariaitalica)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)等物種的水通道蛋白序列相似性相對較低，原因是上述物種與小麥‘科農199’的親緣關系相對較遠。

表2 TaTIP1-1c-4BL基因啟動子區(qū)的順式作用元件Table 2 Promotercis-elements of promoter region of TaTIP1-1c-4BL

圖5 TaTIP1-1c-4BL蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of TaTIP1-1c-4BL protein

2.7 TaTIP1-1c-4BL基因在不同組織中的表達分析

選取灌漿期的‘科農199’小麥植株進行脫落酸(ABA)脅迫、過氧化氫(H2O2)脅迫、干旱20% PEG6000脅迫和鹽脅迫，脅迫總時間共計24 h，脅迫前后表型變化不明顯，推測出現該現象的原因與脅迫時間較短有關。檢測TaTIP1-1c-4BL基因在‘科農199’的根、莖、葉、籽粒、穎殼等組織部位的表達量。表達分析結果(圖6)顯示，TaTIP1-1c-4BL基因在根、莖、葉、籽粒、穎殼等組織部位中均有表達，其中在莖中的表達量最高，是根中的9.5倍，其次是在穎殼、葉和籽粒中的表達量，分別是根中的7.1倍、6.5倍和5.4倍，在根中的表達量最少，由此可推測TaTIP1-1c-4BL基因在莖中發(fā)揮主要功能，這可能與小麥莖部負責運輸水分和無機離子有關。

2.8 TaTIP1-1c-4BL基因在不同脅迫下的表達分析

小麥在灌漿期容易遭受逆境脅迫，從而導致產量和質量下降。本研究對灌漿期小麥進行干旱、鹽、ABA和H2O2脅迫處理，檢測TaTIP1-1c-4BL基因在葉片中的相對表達量。結果證明TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量受到外界逆境脅迫的影響，表明TaTIP1-1c-4BL基因在小麥響應逆境脅迫過程中具有重要作用。

圖6 TaTIP1-1c-4BL基因在小麥不同組織中的表達Fig.6 Expression of TaTIP1-1c-4BL gene in different tissues of wheat

與對照相比，在PEG處理下(圖7-A)，TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量下調，在12 h時表達量最低，是處理前的11%，表明干旱脅迫能夠下調TaTIP1-1c-4BL基因在灌漿期小麥葉片中的表達量。在NaCl處理下(圖7-B),TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量先下調后上調，在8 h表達量最低，是對照的10%；在24 h表達量最高，為處理前的1.32倍。在H2O2處理下(圖7-C),TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量先下調后上調，在8 h表達量最低，是對照的12%；在24 h時表達量最高，為處理前的1.23倍。在ABA處理下(圖7-D),TaTIP1-1c-4BL基因的相對表達量下調，在8 h時表達量最低，為處理前的20%，8～12 h過程表達量低于對照，但有逐漸提高的趨勢。在H2O2、ABA處理以及鹽脅迫下，TaTIP1-1c-4BL基因在小麥灌漿期葉片中的表達模式相似，均是先下調后上調，8 h時表達量最低，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白在灌漿期小麥葉片響應鹽、H2O2和ABA脅迫8 h后發(fā)揮其主要功能，因此推測TaTIP1-1c-4BL蛋白可能在灌漿期小麥葉片響應H2O2、ABA處理以及鹽脅迫時作為次級水通道蛋白存在。

圖7 TaTIP1-1c-4BL基因在不同處理下的表達分析Fig.7 Expression patterns of TaTIP1-1c-4BL gene under different treatments

3 討 論

小麥在灌漿期對水分的要求較高，干旱、鹽等逆境脅迫會嚴重影響小麥灌漿期的生長、結實，從而影響小麥的產量和質量。因此，發(fā)掘小麥抗逆基因，培育小麥抗逆品種至關重要。逆境脅迫影響小麥正常生長發(fā)育的原因在于能夠造成小麥植株細胞的失水，與其他家族的水通道蛋白相比，TIP主要通過調節(jié)細胞的滲透壓維持小麥植株細胞的正常功能和形態(tài)，因此，TIP在小麥響應逆境脅迫中方面發(fā)揮了重要作用。

該研究發(fā)現TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6個跨膜域，與其他報道中水通道蛋白跨膜域的數量相同[23-25]，證明TaTIP1-1c-4BL蛋白為跨膜蛋白且具有典型的水通道蛋白跨膜結構。三級結構模型顯示TaTIP1-1c-4BL蛋白以4個單體形成同源四聚體的形式存在，每個單體有6個跨膜α螺旋，由5個短環(huán)相連接，6個α螺旋和兩個NPA結構域共同構成了可供水及其他不帶電荷的小分子通過的孔道[26]，且每個單體中間的孔道相互獨立、互不干擾。這種高度保守的結構對保持水通道蛋白結構的穩(wěn)定以及準確發(fā)揮其功能具有重要意義。

TaTIP1-1c-4BL基因的啟動子區(qū)具有脫落酸、茉莉酸甲酯、生長素響應元件等與植物激素相關的順式作用元件以及光響應元件和低溫響應元件，推測TaTIP1-1c-4BL基因的表達受到脫落酸、茉莉酸甲酯、生長素等植物激素信號以及光照和低溫的調控。許多植物激素同時是小麥響應逆境脅迫的內源信號分子，如脫落酸(ABA)是公認的水分脅迫響應介質。本研究證明外源ABA的應用能夠調節(jié)TaTIP1-1c-4BL基因在小麥灌漿期葉片中的表達。因此，TaTIP1-1c-4BL基因可能通過依賴ABA的途徑調節(jié)小麥對逆境脅迫的響應，從而提高小麥對逆境脅迫的耐受性。

TaTIP1-1c-4BL蛋白序列系統(tǒng)進化樹構建結果表明該蛋白與來自粗山羊草和大麥中的水通道蛋白的序列相似性較高，原因在于粗山羊草、大麥與小麥‘KN199’的親緣關系較近，普通小麥的D基因組來源于粗山羊草。TaTIP1-1c-4BL蛋白與來自珍珠粟、谷子、高粱、玉米等物種的水通道蛋白序列相似性較低，原因是相對于粗山羊草和大麥，上述物種與小麥‘KN199’的親緣關系較遠。這與其他報道中所得到的結論相似[26]，因此可以推測TaTIP1-1c-4BL蛋白序列可作為判斷禾本科植物親緣關系遠近的依據。

水通道蛋白能夠響應逆境脅迫而差異表達[8]。大多數的TIP會在干旱脅迫6 h后表達量上調，但本研究發(fā)現TaTIP1-1c-4BL基因在PEG脅迫下的相對表達量下調，這表明TaTIP1-1c-4BL基因在灌漿期小麥葉片響應干旱脅迫過程中可能發(fā)揮了消積的調控作用。前人研究表明在小麥根部和葉片中高表達的水通道蛋白基因，在干旱脅迫時表達量會大幅上調，如TaTIP2-3、TaTIP2-4或TaTIP4-1。而在小麥其他組織部位高表達的水通道蛋白基因在干旱脅迫時表達量變化不明顯或下調，例如TaTIP1-1、TaTIP2-2[27]和TaTIP4-1C1在干旱脅迫時表達量均下調[7]，這可能與小麥的抗旱能力有關。TaTIP1-1c-4BL基因是在小麥莖部高表達的水通道蛋白基因，這點與前人的研究相符合。TaTIP1-1c-4BL 基因在NaCl、ABA及H2O2處理下的表達模式相似，相對表達量均先下調后上調，符合次級水通道蛋白的表達特點，因此推測TaTIP1-1c-4BL蛋白可能在灌漿期小麥葉片響應ABA、H2O2及鹽脅迫時作為次級水通道蛋白存在，在灌漿期小麥響應NaCl、ABA及H2O2等脅迫過程中發(fā)揮積極作用，這可能與TaTIP1-1c基因的啟動子區(qū)具有多個順式作用響應元件有關。

大量研究表明，水通道蛋白不僅能夠轉運水及其他小分子，同樣也是植物響應干旱、鹽、低溫等逆境脅迫的重要組成部分。番茄(Solanumlycopersicum)中的SlTIP2;2[28]、陸地棉(Gossypiumhirsutum)中的GhPIP2;7[29]以及小麥中的TaAQP7、TaAQP8[20]對于植物響應干旱脅迫和鹽脅迫具有正調控作用。但也有報道稱某些水通道蛋白對植物響應逆境脅迫具有負調控作用。如水稻(Oryzasativa)中OsPIP1;1[30]在鹽脅迫下表達量下降，大麥(Hordeumvulgare)中的HvPIP2;1[30]在干旱脅迫下表達量減少。近年來，水通道蛋白一直是研究的熱點，但研究多集中于水稻和大豆中，由于小麥基因組的異源六倍體性質，小麥中的水通道蛋白研究較少，對其響應逆境脅迫的作用了解不足。本研究為了解TaTIP1-1c-4BL基因的抗逆功能奠定了基礎，下一步研究將通過轉基因技術深入了解TaTIP1-1c-4BL基因的功能及其在小麥響應逆境脅迫過程中的作用。