象草ITS2序列的克隆與比較分析

蔡升 楊平 續晨 蔡小寧

摘要? ? 從象草葉片提取了DNA，進行PCR擴增，獲得了一段長度為283bp的ITS2序列。不同物種間ITS2序列的系統發育分析表明，象草與玉米的親緣關系最近，屬于單子葉植物類群。與GenBank中其他來源的ITS2序列進行比較分析，發現多條ITS2序列之間存在少量堿基的差異。針對這種情況，提出可以采用“基準”ITS2序列作為解決辦法。

關鍵詞? ? 象草;“基準”ITS2序列;克隆

中圖分類號? ? Q943.2? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）21-0220-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Cloning? and? Comparative? Analysis? of? ITS2? Sequence? of? Pennisetum? purpureum

CAI Sheng 1，2? ? YANG Ping 1? ? XU Chen 1? ? CAI Xiao-ning 1 *

（1 College of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing Jiangsu 211171; 2 College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing Jiangsu 210095）

Abstract? ? DNA was extracted from Pennisetum purpureum leaves and amplified by PCR， and an ITS2 sequence with length of 283bp was obtained. Phylogenetic analysis of ITS2 sequences among different species showed that Pennisetum purpureum and corn had the closest genetic relationship and belonged to the monocotyledonous group. Compared with ITS2 sequences from other sources in GenBank， it was found that there were a few base differences among multiple ITS2 sequences. In view of this situation， it was proposed that the "benchmark" ITS2 sequence could be used as a solution.

Keywords? ? Pennisetum purpureum; "benchmark" ITS2 sequence; cloning

象草（Pennisetum purpureum）是一種新型的高產高蛋白牧草，具有適應性強、繁殖快、產量高、質量好、利用周期長等特點，有較高的營養價值，柔軟多汁，適口性好，牛、羊、鵝等畜禽均喜食，幼嫩時期也是豬、魚的優良飼料。除四季給家禽提供青飼料外，也可調制成干草或青貯料備用[1-5]。此外，還可以制備成氣體、固體和液體等能源產品，以替代化石能源能減少溫室氣體的增長、減少碳的排放并消除煙霧，使環境和相關能源問題得以解決[6]。研究結果表明，象草用于重金屬鎘污染的土壤的修復也有很好的效果，修復效率甚至超過了鎘超富集植物三葉鬼針草[7]。

有研究發現，植物基因組DNA上有一段稱為核糖體基因DNA轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）的序列，可以作為物種分類鑒定的條形碼，Chen等[8]研究了超過4 000種植物的樣品后發現，ITS2序列的物種鑒別成功率大于92.7%。目前有關象草的ITS2序列鮮有報道，在本試驗中，擬提取其基因組DNA，克隆其ITS2序列，并進行序列的比較分析，提供相應信息，為今后的進一步研究打下基礎。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

象草葉片。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 引物序列。上游引物序列為ATGCGATACTTG-GTGTGAAT，下游引物序列為GACGCTTCTCCAGAC-TACAAT。

1.2.2? ? ITS2序列的克隆與測序。首先從象草葉片提取基因組DNA，然后用上述引物進行PCR擴增，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定后，將PCR產物送南京擎科生物技術有限公司測序。

1.2.3? ? 序列分析。登錄NCBI網站獲取所需要的ITS2序列，用Lasergene 7.1的子軟件SeqMan分析各種生態型象草ITS2序列的變異，用Clustalx 1.83和MEGA 6軟件構建系統進化樹。

2? ? 結果與分析

2.1? ? 象草ITS2序列的獲得

用1.2所述的引物以象草葉片DNA為模板進行了PCR擴增，然后對PCR產物測序，得到了一段長度為283 bp的序列，包含部分5.8S序列、完全的ITS2序列和部分26S序列，具體序列已經提交GenBank，序列ID（Accession number）號碼為MT649904。

2.2? ? 不同物種間ITS2序列的系統發育分析

將所獲得的象草ITS2序列和其他一些物種的ITS2序列用Clustalx 1.83和MEGA 6軟件鄰接法（NJ法）構建系統進化樹，結果見圖1。

從圖1可以看出，明顯可以分為3個聚類，象草（Pennisetum purpureum，MT649904）、荸薺（Eleocharis dulcis，AF190604）、姜（Zingiber officinale，LS999889）、美人蕉（Canna indica，FJ939544）、玉米（Zea mays，AF-019817）、小麥（Triticum aestivum，AJ301799）、水稻（Or-yza sativa，AF169230）聚為一類，此類幾個物種均為單子葉植物，其中與玉米關系最為密切;陸地棉（Gossy-pium hirsutum，KF454241）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，LC089989）、紅景天（Rhodiola rosea，KF454616）、大豆（Glycine max，MG237487）、圓葉葡萄（Vitis rotundifolia，MG200158）、水燭（Typha angustifolia，KF454377）、蒲公英（Taraxacum mongolicum，EF114672）、馬齒莧（Portu-laca oleracea，AB823847）聚為一類，此類中除了水燭為單子葉植物外，其他均為雙子葉植物;胡椒（Piper nigrum，LC461757）、銀杏（Ginkgo biloba，Y16892）、馬尾松（Pinus massoniana，JF829706）、云南紅豆杉（Taxus wallichiana，MF785718）聚為一類，此類除了胡椒屬于被子植物外，其余均為裸子植物。

2.3? ? 象草不同生態型ITS2序列的比較分析

將獲得的象草ITS2序列與從GenBank搜尋到的18個其他生態型象草的ITS2序列用Lasergene的子軟件SeqMan進行堿基變異分析，發現ITS2區域的堿基位置能一一對應。不同研究者提交的19個ITS2序列如果被當成同一次實驗的多個克隆的測序結果，可以拼接成一個“基準”ITS2序列，與“基準”ITS2序列比較，各個ITS2序列在對應位置的堿基不變或者變異成其他的堿基。

本文以MT649904序列為參照，則“基準”ITS2序列相對應的位置在第52堿基到第268堿基之間。由表1可知，MT649904、JX156340、JX156338、JX156339、KR350689、AF345232、AY628128、KJ776736這8個序列的ITS2區域內的序列與“基準”ITS2序列相比較，沒有發生任何變化;其他11個序列的ITS2區域內的序列與“基準”ITS2序列相比較，出現1～5個堿基的變異，其中以FJ626356的變異最多，有5個位置的堿基發生了變異。多個來源的序列一起比較堿基發生變異的位置，則分別為第86、94、99、110、130、136、137、181、204、214、246堿基。發生變異最多的為第204堿基的位置，有5個序列發生了變異;其次為第181和第246堿基的位置，有4個序列發生了變異。

3? ? 結論與討論

從構建的系統進化樹可以看出，象草的分類地位處于單子葉植物類別，與玉米關系密切，暗示了其為C4植物，具有高光合效率的特點。各個物種ITS2序列的聚類特點與分類地位基本吻合，表明用ITS2序列進行物種分類鑒定具有較高的正確性。

隨著GenBank中的ITS2序列數據的不斷增加，對一些物種而言，已經積累了很多的序列信息，但是經常發現，同一個物種的多條ITS2序列往往不完全一樣，出現這種情況的原因可能是測序錯誤，也可能不同生態型發生了少量變異。以ITS2序列為參照，進行物種鑒別和系統進化樹分析時，如果隨機選擇其中一條序列，大多數情況下問題不大，但有時可能出現偏差，因而更穩妥的辦法是選擇一條能夠代表該物種的ITS2序列。采用“基準”ITS2序列，顯然是一個解決辦法。今后建立的ITS2序列數據庫，當一個物種的ITS2序列信息積累到足夠數量時，可以專門增列一條“基準”ITS2序列。如果要依靠手工獲取“基準”ITS2序列，可以采用Lasergene的子軟件SeqMan或其他軟件，從GenBank獲得一個物種的多條ITS2序列則往往要逐條搜索和下載，今后需要加強生物信息學軟件的研制，以進一步提高效率。

4? ? 參考文獻

[1] 易顯鳳，賴志強.南方優質象草品種比較試驗初報[J].廣西大學學報（自然科學版），2008，33（3）：313-316.

[2] 孫鏖，鄧薈芬，李彩軍，等.南方三種暖季型牧草品種的比較研究[J].家畜生態學報，2013，34（2）：58-60.

[3] 吳能義，王蘭，陳福海，等.3種熱帶牧草品種比較研究初報[J].中國熱帶農業，2019（6）：74-76.

[4] 滕少花，李冬郁.臺灣甜象草與桂牧 1號雜交象草生產性能比較的觀察 [J].廣西畜牧獸醫，2007，23（6）：243- 244.

[5] 滕少花，李冬郁，姚娜，等.臺灣甜象草新品種高產栽培技術與利用試驗[J].廣西畜牧獸醫，2012，28（3）：131-133.

[6] 雷學軍.速生草本植物替代化石能源降碳除霾技術研究[J].環境工程，2014（8）：151-156.

[7] 覃建軍，唐盛爽，蔣凱，等.象草在南方典型母質土壤中的鎘修復效應[J].水土保持學報，2020，34（2）：372-377.

[8] CHEN S L，YAO H，HAN J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One，2010，5：370-375.

基金項目? ?國家自然科學基金資助項目（31400567）。

作者簡介? ?蔡升（1993—），女，江蘇南京人，在讀博士研究生。研究方向：作物遺傳育種與種質資源評價利用。

通信作者

收稿日期? ?2020-06-27