云紅梨1號HY5基因原核表達載體的構建、表達和純化

蘇俊 陳璐 馬偉榮

摘要：HY5為調控光形態建成的轉錄因子，調控花青素的生物合成與累積。通過構建云紅梨1號HY5基因的原核表達載體，旨在為研究HY5蛋白的生物功能奠定基礎。將云紅梨1號的HY5基因構建到原核表達載體pGEX-4T-1上，并對其進行誘導表達，通過谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）親和層析色譜柱純化融合蛋白。結果表明，重組質粒pGEX-4T-1-PyHY5的酶切檢測及測序結果均正確，表明重組質粒載體構建成功。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結果顯示，用100 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在37 ℃、220 r/min條件下誘導3 h后收集誘導菌株，在BL21菌株中均有明顯的目的條帶，誘導表達后的融合蛋白大小約為43.90 ku;PyHY5蛋白能夠與pGEX-4T-1載體上的GST標簽蛋白進行融合表達。通過研究成功構建了pGEX-4T-1-PyHY5原核表達載體，誘導表達并純化出PyHY5融合蛋白為進一步研究其生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞：HY5基因;云紅梨1號;原核表達載體;誘導表達;純化

中圖分類號： S661.201? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0062-06

我國是梨生產大國，年產量超過世界總產量的60%[1]。梨的果皮有綠色、黃色、褐色、紅色等多種顏色，其中紅皮梨最受消費者的青睞[2]，選育優質紅皮梨已經成為當前國內外的育種目標之一[3]。目前，云南紅梨主要包括早熟早白蜜、中熟32號（又稱美人酥）和中熟35號（又稱滿天紅）、晚熟云紅梨1號，其中云紅梨1號是由云南省農業科學研究院從云南省硯山縣的種質資源中選育而來的[4]，其果皮著色面積遠遠超過其他3種梨，達90%以上。由于云南紅梨外觀色澤鮮艷、內在品質優良，目前已在云南安寧、江川、德宏、麗江、保山等地大面積種植，產品遠銷澳大利亞、新西蘭、泰國等，市場前景廣闊，在國內現已引種到河南[5-7]、貴州[8]、安徽、山東、河北[9]、甘肅[10]等省。

HY5是光形態建成的正調控因子，是光調控植物發育的分子開關[11]。光誘導果皮著色的過程主要包括光作用于光受體、光受體通過某種途徑作用于轉錄因子、轉錄因子調控花青素的生物合成和累積等。云南紅梨果皮的果色著色，主要是矢車菊素-3-O-半乳糖苷在果皮中合成和累積的結果[12]，影響果皮著色的主要因素是光照[13]。本研究對筆者所在課題組前期獲得的云紅梨1號HY5基因的序列進行分析發現，HY5蛋白除了bZIP域外，無其他明顯的結構域，說明由于缺乏潛在的轉錄激活域，使得HY5蛋白要與其他轉錄因子發生協同作用。pGEX-4T-1是一種可以高效表達插入的外源基因的融合蛋白表達載體，帶有tac啟動子，具有氨芐青霉素（Amp）抗性，能夠克服轉錄和轉錄后水平對外源基因的表達可能造成的不利影響[14]。因此，pGEX-4T-1-PyHY5融合蛋白的成功誘導表達和純化，為云紅梨1號依光合成紅色果皮以及PyHY5基因功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料 云紅梨1號果實于2019年9月采自云南省安寧市清水河果園，采后于筆者所在實驗室中進行試驗。使用水果刀迅速削取云紅梨1號的新鮮紅色果皮，立即投入盛有液氮的保溫桶中，之后于實驗室-80 ℃冰箱內保存。大腸桿菌DH5α 感受態細胞及表達菌株Escherichia coli BL21（DE3）感受態細胞，均購自天根生化科技（北京）有限公司;原核表達載體pGEX-4T-1，購自GE Healthcare公司。

1.1.2 主要試劑? 試驗中所用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209-03）及質粒小提試劑盒（DP103-02），購自天根生化科技（北京）有限公司;限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ及T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa公司;LB培養基，購自安琪公司;NI Crystarose FF，購自晶誠生物科技公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），購自Amresco公司。

3 L S1（裂解緩沖液）配方：150 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）。

3 L S2（洗滌緩沖液）配方： 150 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0），9 g NaCl，30 mL 500 mmol/L EDTA。洗滌時取40 mL，加入2 mL 20%Triton X-100。

20 mL S3（洗脫緩沖液，現配現用）配方：1 mL 1 mol/L Tris （pH值為8.0）， 0.2 g 谷胱甘肽（GSH），用去離子水定容至20 mL。

1.1.3 主要儀器與設備? PTC-200 PCR儀、SiGMA 3k15 高速離心機、NANODROP 2000 紫外分光光度計、DYY-10C 型電泳槽和電泳儀，均購自北京六一儀器廠;SYNGENE G： BOX 凝膠成像系統儀，購自英國Syngene公司;TS-1 脫色搖床，購自上海圣科儀器設備有限公司;YLN-III 超強紫外透射儀，購自北京譽朗諾科技有限公司;超聲破碎儀，購自南京先歐儀器制造有限公司;NGC Quest 10 蛋白純化系統儀，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司（Bio-Rad）。

1.2 試驗方法

1.2.1 云紅梨1號HY5基因的克隆 根據已有的蘋果MdHY5基因序列（登錄號：AB710143.1），設計特異性引物（PyHY5-F：5′-ATGCAAGAGCAGGCG-3′;PyHY5-R：5′-TCAATCCGCATTTGCAC-3′）。以云紅梨1號紅色果皮cDNA為模板進行PCR 擴增，PCR 擴增的反應條件：98 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個循環;72 ℃ 5 min?；厥誔CR 產物，加尾，連接到pGEX-4T-1 載體上，轉化E. coli DH5α 感受態細胞，提取質粒，經PCR 檢測和酶切鑒定后測序。

對于構建好的pGEX-4T-1-PyHY5， 挑選菌落進行PCR 鑒定，切取大小正確的條帶后，用 PGEX-5（正向通用引物，序列為5′-GGGCTGGC AAGCCACGTTTGGTG-3′）進行測序檢測。測序結果表明，序列中有包含雙酶切位點（BamHⅠ和XhoⅠ）的PyHY5基因片段，大小為495 bp，且含有雙酶切位點BamHⅠ（GGATCC）和XhoⅠ（CTCGAG），與預期的載體片段相符，說明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達載體構建成功，詳見圖1。

2.2 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達載體的表達

將含有重組質粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表達菌株BL21（DE3）在100 mmol/L IPTG、37 ℃、220 r/min的條件下進行誘導，3 h后收集誘導菌株。12%SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結果見圖2。根據生物信息學分析結果，推測PyHY5的蛋白質大小為17.9 ku，pGEX-4T-1載體上所帶GST標簽蛋白大小為26 ku，因此推測誘導表達出的融合

蛋白大小為43.90 ku。由圖2可知，該融合蛋白在BL21表達菌株中均有明顯表達，且目的蛋白大小與預測蛋白大小吻合，而未誘導重組質粒pGEX-4T-1-PyHY5的原核表達菌株BL21（DE3）在4390 ku處沒有出現明顯條帶，證明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達載體得到了成功表達。

2.3 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達蛋白的可溶性鑒定

選取表達最好的誘導菌液，離心收菌、去除上清后加入600 μL PBS，混勻后，置于超聲破碎離心管中離心，取出上清，向去除上清的沉淀中加入100 μL PBS，混勻，分析目的蛋白是否為可溶性表達。用12% SDS-PAGE 凝膠電泳進行鑒定，由圖3可知，pGEX-4T-1-PyHY5原核表達蛋白經誘導后在約43.90 ku處出現了1條蛋白條帶，在未經誘導的空白對照中沒有出現此條帶;同時，在菌液離心后得到的上清液及沉淀中，位置相近的地方也出現與誘導成功的菌液相同的蛋白條帶，表明pGEX-4T-1-PyHY5原核表達蛋白在上清中也有表達，且可溶性較好。

2.4 pGEX-4T-1-PyHY5原核表達蛋白的純化

收集400 mL大量表達菌體，加入100 mL S1溶液、1 mL 1 mol/L DTT和1 mL 100 mmol/L PMSF，混勻后超聲破碎（6號探頭，功率30%，超聲2 s，停止2 s，持續10～20 min），直至菌液達澄清半透明狀態，離心后收集上清，將商業化GST-瓊脂糖珠加入含有1 mL ddH2O的柱中，待珠子沉淀后，對融合蛋白進行處理和純化。如圖4 所示，PyHY5 融合蛋白經過S1、S2、S3溶液和GST-瓊脂糖珠處理、純化后得到單一的目的條帶，未出現雜帶，該蛋白與大量表達后PyHY5融合蛋白的位置一致，與預期蛋白大小相符，蛋白濃度、純度較高，共獲得8 mL純化蛋白，經測定，純化蛋白的質量濃度為500 μg/mL。

3 討論

光在植物生長發育過程中的意義重大，在調控植物光形態建成的過程中，紅光、遠紅光、藍光、UV-、UV-B等均會影響HY5的積累，而且HY5調控光信號轉導下游的相關基因[15]。目前，在部分植物（如津田蕪菁[16]、擬南芥[17]、油菜[18]等）中，HY5的編碼基因已經被成功克隆，HY5可直接與花青素合成的關鍵基因發生相互作用。在前人研究的植物中，HY5基因編碼的HY5蛋白的C末端具有bZIP結構域，可直接與基因的啟動子作用元件 G-box 結合，從而激活并誘導該基因的表達[11]。Ang等的研究表明，擬南芥的HY5過量表達植株在光下生長時，表現為光形態建成[19]，表明HY5是光形態建成過程中的1個正調控因子。盡管有學者對植物中的HY5進行了一些研究，關于HY5的結構、功能及其分子機制也逐漸明晰，但HY5與其他蛋白的協同作用尚未明確。因此，開展云紅梨1號HY5基因的原核表達研究，可以為深入研究HY5的生物學活性和互作奠定基礎。

大腸桿菌原核表達系統制備重組蛋白有諸多優點，目前已被廣泛應用于植物蛋白的表達研究中[20]。將目標基因轉移到帶有谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）標簽的原核表達載體pGEX-4T-1上，加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷后，tac就會被誘導，tac啟動子后的GST標簽及其后的插入基因就會得到表達[21]。而pGEX-4T-1載體表達的蛋白產物在N端含有GST序列，加入融合標簽GST后，重組蛋白的大小會隨即增加26.0 ku，蛋白正確折疊，以融合形式表達[14]。在本研究中，PyHY5的蛋白質大小僅為17.90 ku，因此表達的融合蛋白分子量應為43.90 ku;此外，由于pGEX-4T-1在表達菌株中高效表達，因此本試驗以 pGEX-4T-1作為表達載體。構建原核表達載體后，在特定條件下被誘導，收集誘導菌株，發現有明顯的目的條帶，蛋白大小為43.90 ku，表明PyHY5蛋白在BL21菌株中高效表達。綜上本研究以pGEX-4T-1作為表達載體，與云紅梨1號PyHY5基因的開放閱讀框構建重組質粒，轉化表達菌株E.coli BL21（DE3）感受態，獲得了陽性的原核表達菌株。同時，用IPTG誘導原核表達載體pGEX-4T-1-PyHY5后，PyHY5蛋白獲得了高效表達，這也為進一步闡明HY5調控花青素生物合成的分子機制奠定了理論基礎。

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