應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)江蘇省水稻苗期與成株期的惡苗病病菌

王曉莉 李哲 楊紅福

摘要：為了解2018年江蘇省田間水稻苗期和成株期的惡苗病病菌組成，應(yīng)用可特異性識(shí)別藤倉(cāng)鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和Fusarium andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)疑似水稻惡苗病樣本47份。結(jié)果表明，苗期與成株期檢測(cè)到的惡苗病病菌組成不同，29份苗期樣本中檢測(cè)到藤倉(cāng)鐮孢、層出鐮孢2種水稻惡苗病病菌的檢出率分別為8966%、27.59%;18份成株期樣本中4種惡苗病菌均有檢出，藤倉(cāng)鐮孢、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和F. andiyazi的檢出率分別為88.89%、50.00%、27.78%、16.67%。結(jié)果表明，藤倉(cāng)鐮孢是江蘇省水稻苗期與成株期惡苗病病原菌的優(yōu)勢(shì)種。

關(guān)鍵詞：水稻惡苗病;苗期;成株期;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

中圖分類號(hào)：S435.111.4+4?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0110-04

水稻惡苗病是水稻重要的病害之一，對(duì)世界各地的水稻均造成了不同程度的危害，嚴(yán)重可造成水稻減產(chǎn)50%[1]。水稻惡苗病對(duì)我國(guó)水稻也造成了不容忽視的危害，江蘇省水稻種植區(qū)在不同年份均發(fā)生過(guò)惡苗病大流行[2]。水稻惡苗病在整個(gè)發(fā)育期均可發(fā)生，其中苗期和成株期是最易發(fā)病的2個(gè)時(shí)期。苗期受害的典型癥狀為秧苗徒長(zhǎng)、莖細(xì)長(zhǎng)、葉片褪綠、須根不發(fā)達(dá)，有些受害秧苗表現(xiàn)為褪綠或矮化，受害嚴(yán)重的出現(xiàn)整株枯死。成株期水稻受害后癥狀與苗期相似，也會(huì)表現(xiàn)徒長(zhǎng)，有些在莖間或節(jié)間倒生不定根，根部和莖基部腐爛，嚴(yán)重的整株枯死[3]。水稻惡苗病病原菌主要通過(guò)種子傳播[4]。由于我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)惡苗病高抗的水稻品種，因此，目前有效的防治手段是使用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，處理的最佳時(shí)期為播種前浸種[5]。

在已知的4種水稻惡苗病病原菌中，對(duì)水稻致病力最強(qiáng)的是藤倉(cāng)鐮孢（Fusarium fujikuroi），其次是層出鐮孢（F. proliferatum）、擬輪枝鐮孢（F. verticilliodes）、F. andiyazi[6]。它們的寄主非常廣泛，包括水稻、玉米、高粱、大豆等重要作物[7-9]。上述病原菌可分泌次生代謝物，如赤霉素、鐮孢菌素和伏馬菌素等。赤霉素為促生長(zhǎng)素，可促進(jìn)細(xì)胞快速伸長(zhǎng)、細(xì)胞間隙增大，使植株節(jié)間伸長(zhǎng)表現(xiàn)徒長(zhǎng)現(xiàn)象;其他代謝物可引起葉片褪綠、植株矮化、死苗等癥狀[10]。在上述4種病原菌中，藤倉(cāng)鐮孢菌引起的水稻惡苗病為系統(tǒng)侵染，病菌在發(fā)病水稻全株組織內(nèi)均有分布，其他3種病原菌為局部侵染，僅在發(fā)病植株的根部和莖基部有分布[11] 。

水稻惡苗病在江蘇省稻區(qū)廣有發(fā)生，但對(duì)在田間引起該病的病原菌組成及發(fā)生頻率知之甚少。本研究應(yīng)用筆者所在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的可特異性識(shí)別藤倉(cāng)鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢、F. andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）檢測(cè)技術(shù)對(duì)2018年來(lái)自江蘇省不同地區(qū)采集的水稻苗期和成株期惡苗病疑似發(fā)病樣本進(jìn)行檢測(cè)，以期了解當(dāng)前江蘇省水稻苗期和成株期引起水稻惡苗病的病原菌組成及其出現(xiàn)頻率。旨在為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣本

2018年6月從江蘇省淮安、鹽城、南通、鎮(zhèn)江、南京、常州、無(wú)錫和蘇州等地采集水稻惡苗病疑似發(fā)病樣本29份（表1），2018年9—10月從江蘇省鹽城、淮安、南通、南京、鎮(zhèn)江、無(wú)錫、常州和蘇州等地采集水稻成株期疑似惡苗病樣本18份（表3）。將收集來(lái)的樣本裝袋，記錄信息并進(jìn)行編號(hào)。

1.2 病組織DNA的提取

在每份疑似稻田發(fā)病樣本中選取10株發(fā)病癥狀明顯的植株剪取其根莖部，長(zhǎng)度為5 mm左右，放進(jìn)無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)混勻，其中一半病組織用來(lái)提取DNA，另一半用來(lái)分離病原菌。將植物組織放進(jìn)滅菌的研缽中，用液氮研磨后，參照DNA提取試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行DNA提取，采用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒DNAsecure Plant Kit。提取好的DNA放-20 ℃冰箱保存。

1.3 水稻惡苗病病菌的LAMP檢測(cè)

采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的4個(gè)分別可特異性檢測(cè)藤倉(cāng)鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和F. andiyazi的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)[12-14]，以從疑似惡苗病組織提取的DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)。

LAMP反應(yīng)體系為2.5 μL 10×ThermoPol Buffer [0.1% Trion-X，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L （NH4）SO4，pH值=88]，4 μL MgSO4（50 mmol/L），4 μL 甜菜堿（5 mol/L），3.5 μL dNTPs（10 mmol/L），內(nèi)引物FIP和BIP（20 μmol/L）各2 μL，外引物F3和B3（10 μmol/L）各0.5 μL，環(huán)引物L(fēng)F和LB（10 μmol/L）各1 μL，2 μL HNB（2.4 mmol/L），1 μL Bst DNA 聚合酶（8 U/μL）以及2 μL模板（從惡苗病組織中提取）DNA。由反應(yīng)結(jié)束后的顏色直接判定結(jié)果，藍(lán)色為陽(yáng)性，紫色為陰性。

1.4 水稻惡苗病病原菌的分離與驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證水稻惡苗病病菌的LAMP檢測(cè)結(jié)果，選取部分LAMP結(jié)果呈陽(yáng)性的水稻惡苗病樣本的根莖部進(jìn)行病原菌分離。用70%乙醇消毒 30 s，2%次氯酸鈉消毒2.5 min，無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌濾紙片吸去表面自由水后放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基平板上，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h。從長(zhǎng)出的菌落邊緣切取2 mm×2 mm菌絲塊移至新的PDA培養(yǎng)基上純化。純化后的分離物根據(jù)形態(tài)和堿基序列比對(duì)進(jìn)行鑒定。分離物DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒，通過(guò)擴(kuò)增TEF-1α基因序列及序列比對(duì)進(jìn)行惡苗病病菌菌種的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期水稻疑似惡苗病樣本的LAMP檢測(cè)結(jié)果

4個(gè)LAMP檢測(cè)體系對(duì)來(lái)自蘇州市鳳凰鎮(zhèn)的武運(yùn)粳30稻苗的疑似發(fā)病樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，可特異性識(shí)別藤倉(cāng)鐮孢（4號(hào)反應(yīng)管）和層出鐮孢（5號(hào)反應(yīng)管）的LAMP檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，判定武運(yùn)粳30稻苗發(fā)病樣本中包含藤倉(cāng)鐮孢和層出鐮孢2種水稻惡苗病病菌，說(shuō)明該樣本混合有由藤倉(cāng)鐮孢或?qū)映鲧犳咔秩景l(fā)病的病苗，或是由兩者復(fù)合侵染引起的。其他2種病原菌（2號(hào)和3號(hào)反應(yīng)管）的LAMP檢測(cè)結(jié)果呈陰性，表明武運(yùn)粳30的樣本中不含擬輪枝鐮孢和F. andiyazi。

供試29份苗期水稻惡苗病疑似樣本的檢測(cè)結(jié)果（表1）顯示，有26份檢測(cè)到藤倉(cāng)鐮孢，檢出率達(dá)89.66%;8份樣本檢出層出鐮孢，檢出率為2759%;有3份未檢測(cè)出惡苗病病菌。

在上述26份陽(yáng)性樣本中，有18份僅檢測(cè)到藤倉(cāng)鐮孢，說(shuō)明上述發(fā)病樣本是由該病原菌單獨(dú)侵染的;另有8份樣本同時(shí)檢測(cè)到藤倉(cāng)鐮孢和層出鐮孢，說(shuō)明這8份發(fā)病樣本由兩者復(fù)合侵染引起。結(jié)果表明，藤倉(cāng)鐮孢是2018年江蘇省水稻苗期惡苗病的優(yōu)勢(shì)病原菌。

2.2 苗期樣本的病原菌分離

為驗(yàn)證苗期LAMP檢測(cè)結(jié)果的可靠性，選擇5份LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的秧苗樣本進(jìn)行分離，包括武運(yùn)粳30、2份來(lái)自蘇州市不同地域的南粳5055、南京市的1個(gè)未知品種，以及1份未檢測(cè)到惡苗病病菌的武運(yùn)粳30稻苗樣本（表2）。分離結(jié)果表明，與LAMP的檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明本研究的LAMP檢測(cè)結(jié)果是可靠的。

2.3 成株期疑似水稻惡苗病樣本的LAMP檢測(cè)結(jié)果與分離

由表3可知，有16份樣本檢測(cè)出藤倉(cāng)鐮孢，檢出率達(dá)88.89%;擬輪枝鐮孢、層出鐮孢和F. andiyazi的陽(yáng)性樣本數(shù)分別為9、5、3份，檢出率依次為50.00%、27.78%、16.67%。與苗期樣本的檢出率相比，擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、F. andiyazi的檢出率有所升高。

在16份LAMP檢測(cè)陽(yáng)性樣本中，有7個(gè)樣本僅檢測(cè)出藤倉(cāng)鐮孢，說(shuō)明這7份樣本是由藤倉(cāng)鐮孢單獨(dú)侵染引起發(fā)病。另有9份樣本中檢測(cè)出2種或2種以上水稻惡苗病病菌，占總樣本的50.00%，表明這些發(fā)病樣本可能是由2種及2種以上惡苗病病菌復(fù)合侵染引起。在上述9份樣本中有2份樣本檢出4種惡苗病病菌，4份樣本中檢出3種惡苗病病菌（其中檢出藤倉(cāng)鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢的樣本有3份，檢出藤倉(cāng)鐮孢、擬輪枝鐮孢、F. andiyazi的有1份），3份樣本檢測(cè)出2種惡苗病病菌（均為藤倉(cāng)鐮孢和擬輪枝鐮孢）。在供測(cè)的所有樣本中，未發(fā)現(xiàn)由層出鐮孢、擬輪枝鐮孢或F. andiyazi單獨(dú)侵染發(fā)病的樣本。

進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性樣本進(jìn)行病原菌分離，有14份樣本分離出藤倉(cāng)鐮孢，7份樣本分離出層出鐮孢，1份樣本分離出F. andiyazi，所有樣本均未分離到擬輪枝鐮孢。需要指出的是，7份分離出層出鐮孢的樣本亦同時(shí)分離出藤倉(cāng)鐮孢。病原菌分離與鑒定結(jié)果表明，藤倉(cāng)鐮孢是江蘇省水稻成株期引起水稻惡苗病的優(yōu)勢(shì)種，其他3種惡苗病病菌亦有不同程度出現(xiàn)，但僅起輔助作用。關(guān)于擬輪枝鐮孢檢出率較高（50.00%）而分離率為零的原因尚不清楚。可能原因之一為藤倉(cāng)鐮孢為強(qiáng)勢(shì)致病菌株，而擬輪枝鐮孢可能僅起伴隨侵染作用，并在發(fā)病組織中處極弱勢(shì)地位。

3 結(jié)論與討論

對(duì)2018年采集自江蘇省8個(gè)不同地區(qū)的47份水稻惡苗病疑似樣本進(jìn)行LAMP檢測(cè)的結(jié)果表明，已知的4種惡苗病病菌在江蘇省均有分布，其中藤倉(cāng)鐮孢是當(dāng)前江蘇省稻區(qū)引起水稻惡苗病的優(yōu)勢(shì)種，其他3種惡苗病病菌也有檢測(cè)到，但罕有單獨(dú)侵染引起惡苗病的病例，而似多與藤倉(cāng)鐮孢復(fù)合侵染引起發(fā)病，提示上述3種病原菌在江蘇省水稻惡苗病的發(fā)生中可能起輔助作用。本研究結(jié)果對(duì)了解當(dāng)前江蘇省稻區(qū)水稻惡苗病病原菌組成具有重要價(jià)值，也可為該病的防治提供參考。

LAMP檢測(cè)技術(shù)是21世紀(jì)初建立的一種快速分子檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR方法相比，該檢測(cè)技術(shù)特異性更強(qiáng)、靈敏度更高（是傳統(tǒng)PCR的10～100倍）、檢測(cè)所需時(shí)間更短（完成1個(gè)樣本的檢測(cè)僅需2 h左右）。該檢測(cè)技術(shù)不需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求不高，可以從發(fā)病組織提取的DNA中特異性識(shí)別目標(biāo)病原菌的靶標(biāo)序列，因此可以在快速診斷病害的同時(shí)完成病原菌的鑒定[15]。本研究采用的4個(gè)惡苗病病菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)體系，不僅可以用于惡苗病的快速診斷，也可用于種子攜帶惡苗病病菌的檢測(cè)和土壤帶菌檢測(cè)[11]。

種子攜帶惡苗病病菌是該病的重要傳播途徑。有報(bào)道指出，水稻種子主要攜帶藤倉(cāng)鐮孢和層出鐮孢[16]，本研究對(duì)發(fā)病秧苗的檢測(cè)結(jié)果與袁詠天等的研究結(jié)果[16]基本一致。該病在大田成株期的病原菌組成較苗期復(fù)雜，提示擬輪枝鐮孢和F. andiyazi的主要侵染可能來(lái)自秧苗移植后的稻田田間。

參考文獻(xiàn)：

[1]Desjardins A E，Manandhar H K，Plattner R D，et al. Fusarium species from nepalese rice and production of mycotoxins and gibberellic acid by selected species[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（3）：1020-1025.

[2]秦玉金，劉學(xué)儒，楊 進(jìn)，等. 水稻惡苗病重發(fā)原因淺析及防治對(duì)策[J]. 上海農(nóng)業(yè)科技，2013（5）：111，95.

[3]韓煥忠，朱 萍，王曉艷. 青岡縣水稻常見病害的發(fā)病癥狀及防治措施[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（1）：120，123.

[4]Matic S，Gullino M L，Spadaro D. The puzzle of bakanae disease through interactions between Fusarium fujikuroi and rice[J]. Frontiers in Bioscience，2017，9（2）：333-344.

[5]彭小林，王 軍，王遠(yuǎn)堅(jiān). 2016年永新縣水稻惡苗病的發(fā)生特點(diǎn)及防治對(duì)策[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（8）：128，130.

[6]Wulff E G，Sürensen J L，Lübeck M，et al. Fusarium spp. associated with rice Bakanae：ecology，genetic diversity，pathogenicity and toxigenicity[J]. Environmental Microbiology，2010，12（3）：649-657.

[7]任 旭，朱振東，李洪杰，等. 輪枝鐮孢SSR標(biāo)記開發(fā)及在玉米分離群體遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（1）：52-66.

[8]Arias M M，Munkvold G P，Leandro L F. First report of Fusarium proliferatum causing root rot on soybean （Glycine max） in the United States[J]. Plant Disease，2011，95（10）：1316.

[9]Marasas W O，Rheeder J P，Lamprecht S C，et al. Fusarium andiyazi sp. nov.，a new species from sorghum[J]. Mycologia，2001，93（6）：1203-1210.

[10]Niehaus E M，Kim H K，Münsterktter M，et al. Comparative genomics of geographically distant Fusarium fujikuroi isolates revealed two distinct pathotypes correlating with secondary metabolite profiles[J]. PLoS Pathogens，2017，13（10）：e1006670.

[11]戎振陽(yáng). 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速診斷水稻惡苗病[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018：43-52.

[12]Rong Z Y，Yuan Y T，Ye W W，et al. Rapid diagnosis of rice bakanae caused by Fusarium fujikuroi and F. proliferatum using loop-mediated isothermal amplification assays[J]. Journal of Phytopathology，2018，166（4）：283-290.

[13]曾丹丹，戎振洋，袁詠天，等. LAMP快速診斷由擬輪枝鐮孢引起的水稻惡苗病[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（2）：286-292.

[14]戎振洋，袁詠天，曾丹丹，等. 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速診斷由Fusarium andiyazi引起的水稻惡苗病[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2018，48（2）：256-262.

[15]王芝涵，王春偉，高海馨，等. 引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（3）：581-585.

[16]袁詠天，戎振洋，葉文武，等. 應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)江蘇水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2018，32（5）：493-500.宋兆欣，曹坳程，李 林，等. 50%草除靈懸浮劑防除稻旱輪作油菜田1年生闊葉雜草及其作物安全性評(píng)價(jià)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：114-117.