正常和低品質中華絨螯蟹腸道菌群結構的比較分析

陸宏達 趙歡 張小俊

摘要：為探討正常與低品質中華絨螯蟹的腸道菌群結構差異，采用高通量測序技術，測定細菌16S rDNA V3 V5區基因序列，通過生物信息學方法，分析比較腸道菌群結構和多樣性以及可培養菌群結構的特點。結果表明，中華絨螯蟹正常組（NG）腸道中絕對優勢菌群為厚壁菌門（93.54%），而其他門的豐度均很低（2.81%以下），其中以厚壁菌門的乳球菌屬豐度最高（86.00%）;低品質組（LG）以厚壁菌門（62.60%）、變形菌門（22.42%）、擬桿菌門（5.74%）和軟壁菌門（5.69%）為主，其中以厚壁菌門的尚無屬名的ZOR0006（46.20%）和變形菌門的Caedibacteraceae uncultured（21.33%）豐度最為優勢，厚壁菌門的乳卵屬（5.81%）和乳球菌屬（4.63%）以及軟壁菌門的Candidatus Bacilloplasma屬（526%）豐度較高。低品質組腸道中與營養代謝和生長相關的厚壁菌門顯著降低和擬桿菌門顯著增加，通過提高腸道中厚壁菌門和減少擬桿菌門豐度從而降低兩門間的豐度比，有望減少低品質河蟹的出現。可培養菌群的分析，正常培養組（NCG）絕對優勢菌群為變形菌門（95.86%），其中以變形菌門的檸檬酸桿菌屬（61.40%）和氣單胞菌屬（3167%）為主，同樣低品質培養組（LCG）類似于正常培養組，絕對優勢菌群也為變形菌門（99.91%），以檸檬酸桿菌屬（50.02%）和氣單胞菌屬（36.16%）為主，但這2屬在正常組和低品質組腸道中豐度很低，分別在0.01%～0.19%范圍內，表明這2屬在培養基上極易培養，生長繁殖快，但在腸道中生長繁殖可能受到高豐度其他菌群的抑制作用，而處于低豐度狀態。研究結果可為調節低品質中華絨螯蟹腸道菌群結構和制定減少低品質中華絨螯蟹措施提供理論依據。

關鍵詞：中華絨螯蟹;低品質;腸道;菌群結構;高通量測序

中圖分類號： S917;S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0170-08

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，20世紀90年代規模化人工繁殖成功，為河蟹大規模養殖奠定了基礎，經過20多年的發展，養殖技術、河蟹規格、產量和品質不斷提高，病害不斷減少，但在河蟹養成過程中，還經常出現一些非病原引起的低品質河蟹，不同的年份低品質河蟹出現率不一樣，最高年份有些養殖區出現低品質河蟹的池塘可達20%左右，一般養殖區出現低品質河蟹的池塘在5%左右。這些河蟹主要表現為蟹體消瘦、肉質鮮美度差、特有風味減弱、肥滿度和肝胰腺指數顯著降低以及幾乎無死亡現象等特征，直接影響河蟹的商品價值和經濟效益。患生物性疾病河蟹特征，除活力低和死亡率高外，很少全面地涉及到類似于低品質河蟹的肉質鮮美度差、肥滿度和肝胰腺指數低等特征的報道，患細菌性等生物性疾病的河蟹，通常屬于急性型或亞急性型疾病，一般死亡率50%左右，嚴重時在短期內死亡率可高達80%以上[1-3]，與低品質河蟹幾乎無死亡現象具有本質的區別。造成低品質河蟹的相關因素鮮有報道，只有影響河蟹風味方面的研究，如養蟹塘中種植伊樂藻組的河蟹肌肉鮮味氨基酸含量和幾種肝胰腺脂肪酸含量等均顯著高于無伊樂藻組，但肝胰腺指數差異不顯著[4]，河蟹在8‰低鹽度海水暫養1～2周可以提高河蟹肌肉鮮味和甜味2個主要滋味[5]。已有研究表明生物腸道內菌群結構對機體的營養代謝、吸收和生長等有重要影響[6-8]，河蟹腸道菌群結構與出現低品質河蟹是否存在一定關系未見研究報道，本研究通過正常和低品質河蟹腸道菌群結構以及它們的可培育菌群結構的比較分析，探討腸道菌群的差異性，有助于掌握低品質河蟹腸道菌群結構的特點，為改變河蟹腸道菌群結構，從而減少低品質河蟹的產生提供理論依據，對提高河蟹品質、商品價值、經濟效益和河蟹養殖業健康持續發展等方面都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗蟹和腸道菌群的采集

1.1.1 試驗蟹 河蟹采用地籠的方式于2018年9月下旬采于江蘇省興化市安豐鎮的成蟹養殖塘，用地籠方法獲得的低品質河蟹采自面積約為 0.52 hm2 且幾乎沒有發現正常河蟹的蟹塘，用相同方法獲得的正常河蟹采自面積約為0.50 hm2且沒有發現低品質河蟹的蟹塘，這2個蟹塘的水深、水草種類和覆蓋率、水質清澈度、透明度等養殖環境和養殖方法相似，蟹種來源于同一個蟹種養殖場。正常河蟹和低品質河蟹各取20只，河蟹洗凈晾干后分別進行體質量和殼長測定，再置于解剖盤中用70%的乙醇棉球擦拭河蟹體表進行消毒，無菌操作打開河蟹甲殼，取出肝胰腺稱質量。正常河蟹和低品質河蟹的體質量、殼長、肥滿度和肝胰腺指數采用SPSS 19.0 統計軟件作方差分析，數據用“平均值±標準差”表示，并用t檢驗法作差異性分析。

1.1.2 腸道菌群 每個河蟹甲殼打開后，無菌條件下取出河蟹整個腸道置于無菌培養皿中，用無菌眼科剪剪開腸道，挑去糞便，將剖開的腸道在存有無菌生理鹽水（4 ℃冰箱預冷）的3只離心管中分別進行刮洗后，菌液合并，離心濃縮，正常河蟹腸道洗下的所有菌群液合并于滅菌離心管中作為正常組（normal quality group，簡稱NG），低品質河蟹采用相同方法得到的菌群液作為低品質組（low quality group，簡稱LG）。取少量濃縮菌群液用作腸道的可培養菌群分析，其他保存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.3 腸道可培養菌群 分別取正常組和低品質組的少量濃縮菌群液，進行10倍倍比稀釋后，稀釋105以上的各稀釋度分別設3個平行，在胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，簡稱TSA）平板培養基和血瓊脂平板培養基上28 ℃培養120 h，將2種培養基所有生長的菌落用滅菌牙簽逐個挑出，洗入滅菌的生理鹽水中，離心濃縮后的菌群液分別作為正常培養組（normal quality culturable group，簡稱NCG）和低品質培養組（low quality culturable group，簡稱LCG），保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 細菌DNA提取和PCR擴增

分別將正常組、低品質組、正常培養組和低品質培養組的濃縮菌群液進行DNA提取，300 μL菌群液中分別加入250 μL Buffer ATL和5 μL蛋白酶K，渦旋振蕩1 min至徹底混勻，55 ℃水浴30 min，95 ℃水浴20 min，加入250 μL Buffer DL和250 μL無水乙醇，渦旋混勻15 s;混合液轉入吸附柱HiPure gDNA Micro Colunm中，12 000 r/min離心1 min，倒棄收集管中的濾液，吸附柱裝回收集管中，加入 500 μL Buffer GW2，12 000 r/min離心1 min，倒棄濾液，再重復上一步驟1次，吸附柱裝回收集管中，12 000 r/min離心2 min;吸附柱裝在新的1.5 mL離心管中，加入300 μL Buffer AE于吸附柱中央，放置3 min，12 000 r/min離心1 min，得到白色絮狀物質，晾干15 min，滴加100 μL dd H2O，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，并將各組細菌DNA提取液分別保存于-80 ℃冰箱備用。

采用上游引物341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和改進的下游引物806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′，對提取的各組細菌DNA進行16S rDNA序列的V3 V5可變區PCR擴增（PCR儀：ABI GeneAmp 9700型）。反應體系為10 ng Template DNA，5 μmol/L上下游引物各0.8 μL，4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，04 μL FastPfu DNA Polymerase，補ddH2O至20 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27個循環;最后72 ℃延伸10 min。將每組PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒[愛思進生物技術（杭州）有限公司]切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測后，用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測定量。之后進行文庫構建，連接“Y”形接頭，用磁珠篩選去除接頭自連片段，按照每個樣本測10 000條序列加入1 ng PCR產物的標準富集PCR產物，然后用NaOH溶液變性，獲得單鏈 DNA片段，測序工作由上海德培生物科技有限公司完成。

1.3 16S rDNA高通量測序及數據分析處理

用Illumina MiSeg高通量測序技術進行測序，原始數據通過質控過濾、拼接和去除嵌合體，得到有效數據。利用Usearch 7.1（http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺對有效數據進行操作分類單元（operational taxonomic unit，簡稱OTU）聚類，作為分類和計算的依據，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各分類水平上統計每組樣品的菌群組成，覆蓋率（coverage）、物種豐富度（Chao）指數、香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數公式計算細菌多樣性指數，利用Excel、Venny 2.1、Canoco 5.0軟件分別分析制作稀釋性曲線和屬水平的相對豐度圖、韋恩（Venn）圖和主成分分析（principal component analysis，簡稱PCA）。

2 結果與分析

2.1 正常河蟹與低品質河蟹的特征

正常河蟹與低品質河蟹經顯微鏡檢查只發現極少量鐘形蟲寄生，肌肉和血淋巴液中的致病菌分離培養和回感試驗結果均未發現致病菌，電鏡觀察檢查未見病毒和螺原體等細胞內病原生物，表明低品質河蟹不是由生物性病原引起。河蟹的特征見圖1，正常河蟹蟹殼堅硬，肝胰腺呈黃色或橘黃色，煮熟后具獨特的蟹腥香味口感，肝胰腺豐滿，低品質河蟹消瘦，蟹殼軟，肝胰腺呈淺黃色或淺橘紅色，甚至有些河蟹肝胰腺呈乳白色，口感滋味和蟹腥香味差，肝胰腺明顯減少。正常河蟹與低品質河蟹的殼長分別為（5612 5±0.172 0） cm、（5.602 3±0.333 9） cm，2組河蟹殼長無顯著差異（P>0.05），它們的體質量分別為（10394±8.63） g和（87.09±10.22） g，體質量有顯著差異（P<0.05），肥滿度分別為59.05±325和48.29±3.26，呈現極顯著差異（P<001），肝胰腺指數分別為0.102 5±0.012 6和0.053 2±0.007 3，呈現極顯著差異（P<0.01）。

2.2 OTU聚類、分類學分析、多樣性指數分析

高通量擴增分析生成的原始數據，根據序列末端的box序列校正序列方向，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣本得到正常組和低品質組的有效序列分別為40 468條和43 352條，正常培養組和低品質培養組的有效序列分別為39 828條和 28 527 條。細菌序列平均片段長度無明顯差異，99.92%的序列長度聚集在420～430 bp之間，少數小于400 bp或者大于450 bp，以97%相似性水平為標準劃分可操作分類單元（OTU），正常組和低品質組河蟹腸道中菌群OTU數量分別為113、87個，而相對應的正常培養組和低品質培養組菌群OTU數量分別為18、22個，分別低于它們相對應的正常組和低品質組菌群OTU數量（表1）。

基于隨機選取一定數量的測序序列及其對應的OTU種類得到的稀釋性曲線（圖2），隨著測序深度的增加，各組曲線逐步趨于平坦，說明細菌序列和測序數據量合理并達到飽和，所進行的菌群多樣性分析結果可信，測序結果能夠真實地完整反映樣本中優勢菌群的數量關系和菌群種類。在相同序列數時，正常組菌群OTU數量最多，說明其菌群豐富度最高，其次是低品質組，再次是低品質培養組，正常培養組最低。

由表1可見，無論是河蟹正常組和低品質組菌群的序列，還是正常培養組和低品質培養組菌群的序列，被測出的覆蓋率均達到了0.999 6以上，被測出的概率極高，反映本次測序結果代表了樣本中菌群真實情況。Chao指數通常用于估計OTU數目指數，正常組菌群的Chao指數高于低品質組，表明正常河蟹菌群豐富度高于低品質河蟹，但正常培養組菌群的Chao指數低于低品質培養組，表明其菌群豐富度低于低品質培養組。Shannon指數、Simpson指數則用于估計微生物多樣性，Shannon值越大而Simpson指數越小反映了樣品中微生物多樣性越豐富。正常組菌群的Shannon指數為0.76，小于低品質組的Shannon指數2.0，而Simpson指數相反，正常組菌群的Simpson指數074，高于低品質組的Simpson指數0.26，說明低品質組菌群多樣性高于正常組，低品質河蟹微生物多樣性更為豐富，其腸道內有更多的細菌種類，菌群結構更為復雜。

正常培養組菌群的Chao、Shannon、Simpson指數與低品質培養組菌群的指數比較接近，反映了正常河蟹腸道中培養出的菌群結構類似于低品質河蟹腸道中培養出的菌群結構。

2.3 菌群結構組成及相對豐度

對各組的腸道菌群全部有效序列進行歸類操作分析，統計不同OTU所對應的細菌門類及相對豐度，優勢菌門類和相對豐度見表2。正常組和低品質組河蟹腸道中前9個優勢菌門類分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、Patescibacteria group、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）。正常組和低品質組河蟹腸道菌群結構都以厚壁菌門優勢度最高，相對豐度分別為93.54%和62.60%，前者豐度顯著高于后者;其次是變形菌門，分別為2.65%和22.42%，前者豐度顯著低于后者，2組的這2個門合計豐度分別占各自組總豐度的93.07%、86.18%;正常組擬桿菌門和軟壁菌門豐度分別為0.01%、0.13%，分別低于低品質組5.74%、5.68%的豐度;2組在放線菌門、藍藻菌門和Patescibacteria group均只有極低的豐度;正常組的梭桿菌門和低品質組的浮霉菌門均沒有豐度。2組的菌群結構在門水平上具有較大的差異。

正常培養組和低品質培養組河蟹腸道中培養菌群的優勢菌群均是變形菌門，分別為95.86%和99.91%。前者的厚壁菌門豐度僅為4.14%，而其他7個門類均沒有豐度，無可培養菌群，后者的厚壁菌門、擬桿菌門和梭桿菌門豐度極低，有極少量的可培養菌群，軟壁菌門等其他5個門類均沒有豐度，無可培養菌群，2組的可培養菌群結構在門水平上具有相似性。

篩選出每組豐度最高的前14種OTU所對應的菌屬，在屬水平上對每組腸道菌群結構及分布進行統計分析（圖3）。正常組腸道中乳球菌屬（Lactococcus）豐度最高，達到86.00%，低品質組腸道中乳球菌屬豐度較低，為4.63%，后者豐度最高的菌屬是尚無屬名的ZOR0006，相對豐度達4620%，歸屬于厚壁菌門的韋榮球菌科（Erysipelotrichaceae），前者的ZOR0006相對豐度只有3.64%。低品質組的Caedibacteraceae uncultured、乳卵屬（Lactovum）、Candidatus Bacilloplasma、Roseimarinus的豐度分別為21.33%、5.81%、5.26%和3.95%，均分別高于正常組只有0.01%、0.01%、0.12%、0.01%的豐度。除乳桿菌屬（Lactobacillus）在正常組豐度外，梭桿菌屬等其他8個屬在屬水平上均有一定的豐度，但均低于3.0%，2組的菌群結構在屬水平上具有較大的差異。

正常培養組與低品質培養組可培養菌群的優勢菌群均為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），豐度分別為61.40%、50.02%，其次是氣單胞菌屬（Aeromonas），豐度分別為31.67%、36.16%，2組這2個屬合計豐度分別為93.07%、86.18%。正常培養組乳球菌屬有4.14%的可培養菌群豐度，優勢度較低，正常培養組假單胞菌屬（Pseudomonas）和低品質培養組梭桿菌屬（Fusobacterium）、假單胞菌屬和腸球菌屬（Enterococcus）豐度均為0.01%，可培養菌群很少。2組的ZOR0006和乳卵屬等其他8個屬均沒有豐度，無可培養菌群。2組的可培養菌群結構在屬水平上具有相似性。

2.4 河蟹腸道中菌群相關性分析

基于各組全部的OTU，通過構建文恩（Venn）圖進一步比較和分析正常河蟹和低品質河蟹腸道中細菌物種間差異性的相互關系。正常組和低品質組河蟹腸道菌群共鑒定出OTU數量分別為113個和87個，其中前者特有的OTU數量為62個，占全部OTU數量的41.6%，后者特有的OTU數量為36個，占全部OTU數量的24.2%，二者共有的OTU數量為51個，占全部OTU數量的34.2%（圖4）。正常培養組和低品質培養組河蟹腸道中培養菌群鑒定出OTU數量分別為18個和22個，前者特有的OTU數量為6個，占全部OTU數量的21.4%，后者特有的OTU數量為10個，占全部OTU數量的357%，二者培養菌群共有的OTU數量為12，占全部OTU數量的42.9% （圖5），以上數據表明正常河蟹和低品質河蟹腸道中菌群結構和種類有較大差別，正常培養組和低品質培養組的培養菌群結構和種類也有一些差別。

2.5 腸道中菌群差異性分析

各組間的關系主成分分析見圖6，PC1軸對樣品的貢獻率為67.04%，PC2軸對樣品的貢獻率為32.96%。正常組與低品質組之間在PC1軸上和PC2軸上均相距較遠，它們間具有明顯的差異性。正常培養組和低品質培養組之間距離很近，差異性不明顯，具有較高的相似性，它們在PC1軸上與正常組距離較遠，而在PC2軸上與低品質組距離較遠，具有明顯的差異性。

3 討論

3.1 腸道菌群的分析方法

水生動物腸道內細菌種類繁多， 包括可培養細菌和目前尚不為人知的大量不可培養細菌。對菌群的分析，從最初主要為了確定細菌性疾病的致病菌分析，采用傳統的分離培養技術，再通過回感實驗和生理生化實驗鑒定致病菌的種類，例如王德銘等對草魚和青魚腸炎致病菌的分析[9];API20E系統鑒定[10]等技術，使細菌鑒定更為方便，但離不開細菌分離培養;酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA）[11-12]等免疫酶技術在細菌檢測上得到了廣泛的應用，但也必須首先通過細菌分離培養得到被檢測的細菌，通過制備對應的抗體才能建立免疫酶檢測技術，因此這些技術都無法對不能培養的菌群進行檢測。PCR-DGGE分子生物學技術[13-14]，對可培養和不可培養菌群都可檢測，但還存在一定的局限性，如不能分析痕量微生物，電泳條帶強弱判斷微生物的豐度也不是非常準確，條帶中會包含1種以上16S rDNA序列，要獲悉具體的菌種信息，還需克隆和測序等繁瑣操作。隨著分子生物學的進一步發展，高通量測序技術的出現，以其高的檢測性、準確性和測序深度等特點，目前已在水生動物腸道菌群結構的分析研究中得到應用，對包括痕量的可培養菌群和不能培養的未知菌群都能檢測，并可精確確定它們的豐度等信息[15]。采用高通量測序技術對河蟹腸道菌群分析，具有明顯的分析優勢，能更準確地反映河蟹腸道微生物菌群結構的特點。

3.2 腸道菌群的影響因素

已有報道的養殖魚類腸道菌群影響因素的研究主要采用PCR-DGGE的方法，研究表明，不同月份[16]、食物[17-18]、養殖方式[19]等都會影響腸道菌群結構的組成。河蟹腸道菌群影響因素鮮有研究報道，由于河蟹養殖類似于魚類養殖，河蟹腸道菌群同樣會受到所處的養殖水環境、餌料和養殖方式等因素的影響，河蟹經過育苗、蟹種培育和成蟹養殖各個階段，生活周期長達2年左右，自蚤狀幼體從外界攝食起，腸道菌群開始定殖和微生態便開始逐步建立，蟹種腸道中的菌群主要受到蟹種培育池中的因素影響，在成蟹養殖過程中，成蟹腸道會在成蟹養殖池中重新建立菌群結構，不同的養殖方法和養殖場條件，會使得成蟹腸道菌群產生差異，各自形成一個比較穩定的菌群微生態系統。為了客觀地反映低品質河蟹腸道菌群結構的特點，作為對照的正常河蟹采自于塘大小、水深、種植水草的種類和覆蓋率、水質清澈、高透明度等養殖環境和養殖方法等措施與低品質河蟹的養殖條件和方法類似的池塘。

3.3 腸道菌群結構特點和減少低品質河蟹的途徑

正常河蟹和低品質河蟹腸道的主要優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和軟壁菌門，與人工感染白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus）的河蟹[20]和太湖河蟹[21]腸道的主要優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、軟壁菌門和擬桿菌門以及與餌料中添加果糖等成分的河蟹腸道主要優勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門[22]相似;與上海崇明養殖河蟹腸道中只有變形菌門和擬桿菌門菌群[23]以及養殖河蟹腸道中只發現屬于變形菌門γ-變形菌綱Gammaprotebacteria的菌群[24]有很大差異。不同報道中出現的這些差異，可能與試驗方法、試驗樣本數量、河蟹來源等不同存在一定的關系。正常河蟹與低品質河蟹腸道菌群相對豐度比例上具有明顯差異性，主要表現在厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、軟壁菌門和梭桿菌門等菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度的差異是最值得注意的。報道的肥胖小鼠與瘦小鼠腸道菌群的比較研究中，肥胖小鼠厚壁菌門菌群豐度較大但擬桿菌門菌群豐度非常小，而瘦小鼠相反，認為厚壁菌門與擬桿菌門的比例與能量吸收有很大關系，比例的降低影響小鼠能量吸收和生長[6]，豬腸道菌群研究的報道中，與瘦豬比較，肥胖豬的體質量增加與厚壁菌門菌群豐度存在正相關關系，而與擬桿菌門菌群豐度存在負相關關系[7]。在正常組和低品質組河蟹腸道中這2個門的菌群豐度情況與肥胖小鼠和瘦小鼠以及肥胖豬和瘦豬腸道中的情況有著相似性，河蟹正常組厚壁菌門豐度達93.54%，擬桿菌門菌群豐度只有0.01%，二者的豐度比達9 000倍，而低品質組厚壁菌門豐度為62.60%，擬桿菌門菌群豐度為5.74%，二者的豐度比只有10多倍，豐度比降低類似于肥胖小鼠和瘦小鼠以及肥胖豬和瘦豬的厚壁菌門與擬桿菌門豐度比降低的趨勢。厚壁菌門豐度減少，擬桿菌門豐度增加，推測對河蟹營養吸收和生長具有類似的負面影響，會引起河蟹養殖生產中出現肥滿度和肝胰腺指數低為主要特征的低品質河蟹。通過調節這2個門的屬級菌群結構，增加低品質河蟹腸道中的厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門的豐度，提高厚壁菌門與擬桿菌門豐度比，有望成為減少低品質河蟹發生和發展的途徑之一。河蟹腸道中厚壁菌門由乳球菌屬、尚無屬名的ZOR0006、乳卵屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬構成，其中正常組最優勢的菌屬為乳球菌屬，占86.00%的相對豐度，而低品質組最優勢的菌屬為無屬名的ZOR0006，占46.20%的相對豐度，除乳球菌屬在正常培養組中出現4.14%的可培養菌群豐度外，厚壁菌門的其他菌屬在正常培養組和低品質培養組均為不可培養的菌群。擬桿菌門的優勢菌屬主要是Roseimarinus屬，在正常組和低品質組分別占001%和3.95%，為不可培養的菌群。現有的細菌種名一般是以往通過分離培養后確定的，這些不可培養的菌群因無或缺乏相對應的菌種名和核酸等數據資料，目前無法通過比對的方法確定它們的種名。厚壁菌門和擬桿菌門中絕大多數菌群的不可培養性和目前缺乏不可培養菌群的種級分類資料，無法通過培養方法得到大量菌群，使得采用口喂等人為的方法提高厚壁菌門豐度從而改善低品質河蟹腸道菌群結構變得困難，而降低擬桿菌門豐度相對容易，可通過深入研究使用藥物等方法得以實現。

益生菌具有提高食物消化吸收、促進生長和肥滿度，調節改善腸道菌群的結構和平衡，提高機體免疫力、抗病率和抑制致病菌等作用。益生菌種類繁多，作用較為復雜和多樣，不同的益生菌種類作用有很大差異。在促進生長和提高肥滿度方面，可選擇提高食物消化吸收促進生長的那些益生菌，能夠將不能或不易降解消化吸收的大分子物質轉化成小分子，便于機體的吸收和利用，提高飼料轉化率，其次益生菌本身富含營養物質，添加到飼料中可作為營養物質被攝取吸收利用，同時益生菌在腸道內生長繁殖能夠產生如維生素、氨基酸以及促生長因子等營養物質參與機體的新陳代謝和生長。如已有報道在飼料中添加屬于乳桿菌屬的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus） [25]和屬于芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） [26]，可增加凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）腸道中的蛋白酶和淀粉酶等酶的活性，提高生長率。厚壁菌門的乳桿菌屬在正常組河蟹腸道中相對豐度為3.69%，是低品質組河蟹腸道中相對豐度（2.15%）的1.7倍，盡管不知其對消化吸收和生長有多大程度的影響，但通過飼料中添加乳桿菌和芽孢桿菌等提高食物消化吸收促進生長的益生菌，是減少低品質河蟹值得探索的途徑之一。

[13]李可俊，管衛兵，徐晉麟，等. PCR-DGGE對長江河口八種野生魚類腸道菌群多樣性的比較研究[J]. 中國微生態學雜志，2007，19（3）：268-269，272.

[14]郝耀彤，吳山功，王桂堂，等. 草魚腸道微生物對食物改變適應性變化的研究[J]. 淡水漁業，2015，45（3）：46-51，101.

[15]李小義，張效平，趙 鳳，等. 鱘魚腸道微生物多樣性的研究[J]. 江蘇農業科學，2018，46（24）：164-167.

[16]倪加加，余育和. 不同月份養殖草魚幼魚消化道微生物群落動態變化研究[J]. 水產學報，2013，37（10）：1558-1563.

[17]郁二蒙，張振男，夏 耘，等. 攝食不同餌料的大口黑鱸腸道菌群分析[J]. 水產學報，2015，39（1）：118-126.

[18]鐘 蕾，向建國，曾 丹，等. 餌料對鳡腸道微生物多樣性的影響[J]. 水生生物學報，2016，40（4）：830-835.

[19]夏 耘，余德光，謝 駿，等. 不同養殖方式對鳙腸道細菌群落結構的影響[J]. 南方農業學報，2017，48（5）：907-912.

[20]Ding Z F，Cao M J，Zhu X S，et al. Changes in the gut microbiome of the Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis） in response to white spot syndrome virus （WSSV） infection[J]. Journal of Fish Diseases，2017，40（11）：1561-1571.

[21]Chen X，Di P P，Wang H M，et al. Bacterial community associated with the intestinal tract of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis） farmed in Lake Tai，China[J]. PLoS One，2015，10（4）：e0123990.

[22]吳韜，張振龍，蔡春芳，等. 果膠和木聚糖對中華絨螯蟹腸道菌群結構的影響[J]. 基因組學與應用生物學，2015，34（4）：745-753.

[23]Li K，Guan W，Wei G，et al. Phylogenetic analysis of intestinal bacteria in the Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）[J]. Journal of Applied Microbiology，2007，103（3）：675-682.

[24]狄盼盼，陳小兵，孫國偉，等. 養殖中華絨螯蟹腸道內優勢細菌群組成分析[J]. 微生物學雜志，2014，34（1）：58-61.

[25]王國霞，黃燕華，周 曄，等. 乳酸菌對凡納濱對蝦幼蝦生長性能、消化酶活性和非特異性免疫的影響[J]. 動物營養學報，2010，22（1）：228-234.

[26]胡 毅，譚北平，麥康森，等. 飼料中益生菌對凡納濱對蝦生長、腸道菌群及部分免疫指標的影響[J]. 中國水產科學，2008，15（2）：244-251.

[27]周沛輝. S·S培養基和血瓊脂培養基聯合應用的意義[J]. 現代中西醫結合雜志，1998，7（2）：3-5.

[28]蘇加云. 腹瀉患者糞便病原微生物培養方法的探討[J]. 檢驗醫學與臨床，2011，8（8）：924-925，327.

[29]田佳琪，董文龍，王巍，等. 豬源解鳥氨酸拉烏爾菌分離鑒定與大環內酯耐藥基因檢測[J]. 中國預防獸醫學報，2018，40（1）：1-4.

[30]Reneerkens J，Versteegh M A，Schneider A M，et al. Seasonally changing preen-wax composition：red knots（Calidris Canutus） flexible defense against feather-degrading bacteria[J]. Auk，2008，125（2）：285-290.

[31]林 偉，彭新亮，楊治國.招財魚紅斑病病原——諾卡氏菌的分離與鑒定[J]. 信陽農業高等專科學校學報，2012，22（2）：99-101.

[32]Yano Y，Hamano K，Satomi M，et al. Diversity and characterization of oxytetracycline-resistant bacteria associated with non-native species，white-leg shrimp （Litopenaeus vannamei），and native species，black tiger shrimp （Penaeus monodon），intensively cultured in Thailand[J]. Journal of Applied Microbiology，2011，110（3）：713-722.

[33]Mirbakhsh M，Akhavansepahy A，Afsharnasab M，et al. Screening and evaluation of indigenous bacteria from the Persian Gulf as a probiotic and biocontrol agent against Vibrio harveyi in Litopenaeusvannamei post larvae[J]. Iranian Journal of Fisheries Sciences，2013，12（4）：873-886.

[34]Hwang S H，Kim Y J. Meropenem-resistant bacteria in hospital effluents in Seoul，Korea[J]. Environmental Monitoring and Assessment，2018，190（11）：1-8.

[35]Mwirichia R，Muigai A W，Tindall B，et al. Isolation and characterisation of bacteria from the haloalkaline Lake Elmenteita，Kenya[J]. Extremophiles，2010，14（4）：339-348.

[36]陳 峰，張丹麗，宛寶山，等. 不同培養基與前處理方法對副溶血弧菌MALDI-TOFMS鑒定結果的影響評估[J]. 臨床檢驗雜志，2017，35（4）：264-267.畢振威，徐立波，夏興霞，等. 鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株中和單克隆抗體的制備[J]. 江蘇農業科學，2020，48（20）：178-182.