鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株中和單克隆抗體的制備

畢振威 徐立波 夏興霞

摘要：為了制備鑒別犬瘟熱病毒（CDV）流行強毒株和疫苗弱毒株的單克隆抗體，將CDV 851弱毒株濃縮后經蔗糖密度梯度離心純化，免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞與SP2/0瘤細胞進行細胞融合，經3～5次克隆，間接ELISA篩選，獲得穩定分泌抗CDV的雜交瘤細胞2D12株。該細胞株分泌的單克隆抗體亞類為IgG1κ，與常見犬病毒不發生交叉反應。間接免疫熒光顯示，單克隆抗體與CDV 851毒株發生特異性反應，與桿狀病毒表達的CDV 851毒株H蛋白發生特異性反應。Western blot檢測發現，單克隆抗體與2株CDV強毒株H蛋白不發生反應，而與2株CDV弱毒株H蛋白有特異性反應。雙抗體夾心ELISA顯示，單克隆抗體能檢測CDV疫苗弱毒株而不能檢測CDV強毒株。病毒中和試驗證實，單克隆抗體對CDV 851弱毒株具有中和能力。制備了區分CDV強毒株和疫苗弱毒的單克隆抗體，為CDV的鑒別診斷技術研究奠定了基礎。

關鍵詞：犬瘟熱病毒;單克隆抗體;流行毒株;疫苗毒株;鑒別檢測

中圖分類號： S852.65? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0178-05

犬瘟熱（canine distemper，簡稱CD）是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，簡稱CDV）引起的急性、高度接觸性傳染病。CDV自然感染宿主范圍廣泛，除了食肉目所有8個科外，還擴展到偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物，給養犬行業、經濟動物行業和野生動物保護業等造成了巨大的經濟損失[1]。CD是由流行的CDV野毒株感染引起的，而CD的免疫預防普遍使用活疫苗，如CDV疫苗弱毒株Onderstepoort、CDV3等。CDV疫苗弱毒株的毒力減弱而不引起免疫犬CD發病，但能提供有效的免疫保護。在臨床中，CD疑似犬中檢測和分離的CDV毒株并不一定是致病毒株，很多臨床分離株與疫苗株具有很高的同源性和親緣關系[2-3]，表明犬感染CDV弱毒株的情況可能比較普遍，也可能分離的毒株就是免疫接種的疫苗弱毒株。目前，鑒別和區分CDV野毒株和疫苗弱毒株的檢測方法很少。通過對CDV的基因測序能確定毒株的基因型[4]，但費時、費力，無法實現快速準確診斷，對CD的診斷和治療造成一定的困難。在檢測CDV血清抗體時，也無法判斷是CDV疫苗弱毒株還是CDV野毒株產生的抗體。因此，有效區分CDV強弱毒株是目前亟待解決的重要問題。本研究選用與CDV野毒株存在抗原性差異的 CDV 851 弱毒株免疫小鼠，制備能與CDV弱毒株發生特異性反應而與CDV野毒株沒有反應的單克隆抗體，為區分CDV強弱毒株提供必要的工具。

1 材料與方法

1.1 病毒及主要試劑

Vero細胞長期傳代致弱的CDV851毒株由筆者所在實驗室保存;6～8周齡BALB/c小鼠購自揚州大學比較醫學中心;小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由筆者所在實驗室保存;抗CDV N蛋白單克隆抗體由筆者所在實驗室制備[5];HRP標記羊抗鼠抗體為KPL產品;弗氏完全與不完全佐劑、PEG4000、RPMI-1640培養基、HAT和HT均購自Sigma公司;TMB顯色液購自南京碧云天生物技術有限公司;單抗亞型鑒定試劑盒為Thermo公司產品;鼠源抗Flag標簽抗體購自Sigma公司;FITC標記的羊抗鼠抗體購自武漢博士德生物技術有限公司;同源重組克隆試劑盒（One Step Cloning Kit-C112）、高保真DNA聚合酶（Phanta Max supper-fidelity DNA polymerase）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;表達CDV 851毒株H蛋白的桿狀病毒按參考文獻[6]構建和鑒定;7份CDV陽性臨床樣品來自山東煙臺和江蘇南京的寵物醫院。

1.2 抗原純化和動物免疫

將CDV 851毒株接種于Vero細胞大量培養。根據文獻[7]的方法，采用醋酸鋅沉淀濃縮病毒，經蔗糖密度梯度離心，純化和制備CDV抗原。將純化的CDV抗原用等體積弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，劑量為50 μg/只。以后每隔14 d用等體積弗氏不完全佐劑進行乳化，再免疫2次。3免后間隔7 d斷尾采血，測定血清抗體效價。取免疫小鼠血清和正常BALB/c小鼠血清作為陽性血清和陰性血清。于2011年5月10日至2011年6月21日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.3 細胞融合、篩選與克隆

取CDV免疫的BALB/c小鼠的脾臟，制備脾細胞。根據文獻[7]方法，采用PEG4000將脾細胞與SP2/0細胞進行細胞融合。用純化的CDV 851株抗原作為包被抗原，間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清，選擇2次檢測結果均為陽性的雜交瘤細胞株。采用有限稀釋法對陽性孔進行3～5次亞克隆，至克隆后所有細胞孔上清陽性率100%。將克隆化的CDV單克隆抗體雜交瘤細胞株進行擴大培養，腹腔注射到石蠟致敏的8～10周齡的BALB/c小鼠，7～10 d后收集小鼠腹水，離心后收集上清，分裝后于-20 ℃保存備用。于2011年6月21日至2011年8月25日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.4 單克隆抗體的效價和亞類測定

用間接ELISA測定雜交瘤細胞培養上清和單克隆抗體腹水的效價。按照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒操作說明書，測定雜交瘤細胞2D12株分泌單克隆抗體的亞類。于2011年9月1日至2011年9月7日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.5 單克隆抗體的間接免疫熒光試驗

將Vero細胞鋪在24孔細胞培養板中，同步接種CDV 851株，培養48 h，病變后吸棄細胞培養液，用預冷的無水乙醇于4 ℃下固定30 min，用PBS洗3次;加入雜交瘤細胞培養上清液，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次;加入200倍稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。將Sf9昆蟲細胞鋪到24孔板中，接種表達CDV 851毒株H蛋白的桿狀病毒，按以上相同的方法進行間接免疫熒光試驗。于2011年8月26日至2011年9月1日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.6 單克隆抗體的Western blot檢測

分別用RT-PCR方法擴增CDV 851、疫苗株Onderstepoort以及Asia-4型野毒株NJ（11）2和Asia-1型野毒株NJ（12）3的H基因，采用同源重組的方法克隆到真核表達載體pCAGGS載體上，構建pCAGGS-Flag-H真核表達質粒。將293T細胞鋪到細胞板中，次日細胞長至60%，分別轉染以上4個毒株H蛋白的真核表達質粒，48 h后裂解細胞，加蛋白上樣緩沖液煮10 min，進行Western blot檢測。一抗為雜交瘤細胞培養上清液，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，用ECL顯色試劑盒進行顯影。于2019年4月7日至2019年5月13日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.7 單克隆抗體的ELISA方法

用HisTrapTM Protein G親和層析柱純化單克隆抗體，按5 μg/mL的濃度包被ELISA板，用10%小牛血清的PBST在37 ℃封閉2 h，PBST洗3次，加入CDV陽性樣品，37 ℃作用1 h，PBST洗3次，然后加入HRP標記的抗CDV N蛋白單克隆抗體G3N[7]，37 ℃作用1 h，PBST洗3次，進行ELISA顯色。同時，用雙抗體夾心ELISA試驗檢測犬細小病毒（CPV）、犬流感病毒（CIV）、犬腺病毒1型（CAV-1）和犬冠狀病毒（CCV），檢驗單克隆與犬常見病毒的交叉反應性。于2019年6月9日至2019年6月30日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

1.8 病毒中和試驗

測定CDV 851株的TCID50，確定其病毒滴度。采用固定病毒稀釋抗體的方法檢測單克隆抗體的中和活性。將Vero細胞消化后，接種于96 孔細胞板中。雜交瘤細胞培養上清按2倍倍比稀釋，單克隆抗體腹水按10倍倍比稀釋。將不同稀釋度的雜交瘤細胞培養上清和單克隆抗體腹水分別與等體積含200 TCID50的CDV 851株懸液混合均勻，37 ℃作用1 h，取該病毒-抗體混懸液按0.1 mL/孔接種于上述96孔細胞板中，并設立CDV及正常Vero細胞對照，置37 ℃、5% CO2溫箱中培養，5～7 d后觀察結果。于2011年9月15日至2011年9月30日在江蘇省農業科學院獸醫研究所進行。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體的篩選、效價和亞類

融合的雜交瘤細胞經過3～5次克隆篩選，獲得分泌抗CDV單克隆抗體的雜交瘤細胞2D12株。用間接ELISA測定雜交瘤細胞培養上清的效價是 1 ∶ 103，單克隆抗體腹水的效價是1 ∶ 107。亞類試劑盒鑒定單克隆抗體的重鏈亞類為IgG1，輕鏈亞類為κ型。將雜交瘤細胞傳代20代以上，用間接ELISA抗體檢測細胞培養上清液，結果分泌的抗體效價沒有明顯變化，表明該雜交瘤細胞株具有穩定分泌單克隆抗體的能力。

2.2 單克隆抗體的特異性

采用間接免疫熒光試驗（IFA），檢測單克隆抗體的特異性。雜交瘤細胞2D12株培養的細胞培養上清與CDV 851毒株感染的Vero細胞進行間接免疫熒光試驗，結果表明，單克隆抗體2D12與 CDV 851 毒株感染的Vero細胞發出綠色熒光，而與正常Vero細胞沒有綠色熒光（圖1），表明單克隆抗體與CDV 851毒株發生特異性反應。將表達 CDV 851 毒株H蛋白的重組桿狀病毒感染sf9細胞，間接免疫熒光試驗顯示，雜交瘤細胞2D12株培養的細胞上清與之發出綠色熒光，而與正常的sf9細胞無綠色熒光，表明單克隆抗體與CDV 851毒株H蛋白發生特異性反應（圖2）。用雙抗體夾心ELISA檢測犬細小病毒（CPV）、犬流感病毒（CIV）、犬腺病毒1型（CAV-1）和犬冠狀病毒（CCV），結果均為陰性，表明該單克隆抗體與犬常見病毒不發生交叉反應。

2.3 單克隆抗體與不同CDV毒株的反應性

將表達CDV 851毒株、疫苗株Onderstepoort以及Asia-4型野毒株NJ（11）2和Asia-1型野毒株NJ（12）3的H蛋白的真核表達質粒轉染293T細胞，24 h后收獲細胞樣品，進行Western blot試驗。結果表明，單克隆抗體與CDV 851毒株、Onderstepoort毒株H蛋白在70 ku左右出現特異性條帶，與H蛋白預期大小相符，而與CDV NJ（11）2毒株、CDV NJ（12）3毒株沒有出現條帶（圖3-A、圖3-B）。用Flag抗體檢測CDV NJ（11）2毒株、CDV NJ（12）3毒株H蛋白，在70 ku左右出現特異性條帶，表明這2個毒株的H蛋白得到表達（圖3-C）。以上結果表明，單克隆抗體特異性地識別弱毒株CDV 851和疫苗株Onderstepoort的H蛋白，但是與CDV野毒株NJ（11）2和NJ（12）3毒株不發生特異性反應。為了進一步檢測單克隆抗體與CDV野毒株的反應性，用該單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA方法，檢測9份犬臨床CD樣品，檢測結果均為陰性，空白對照也為陰性;而檢測CDV弱毒株CDV 851和Onderstepoort株時，則為CDV陽性（圖4-A）。用之前建立的雙抗體夾心ELISA[7]檢測，則均為CDV陽性（圖4-B）。以上結果進一步確定單克隆抗體能夠識別CDV疫苗弱毒株，而不能識別臨床CDV野毒株。

2.4 單克隆抗體的中和活性試驗

用CDV 851毒株在Vero細胞上進行病毒中和試驗，檢測單克隆抗體的病毒中和活性。雜交瘤細胞2D12株培養上清液按2倍倍比稀釋，測得的中和效價是1 ∶ 256;單克隆抗體腹水按10倍倍比稀釋，單克隆抗體腹水的中和效價為1 ∶ 106。

3 討論與結論

CDV引起犬和其他陸生食肉動物產生呼吸系統、消化系統、神經系統等多系統臨床癥狀，危害嚴重。CDV H蛋白是刺激機體產生中和抗體的主要蛋白[8-9]。但是，H基因的變異率很高，不同CDV毒株之間H基因的變異性高達11%。因此，H基因已經被廣泛的用于研究CDV的分子流行病學和遺傳進化[1]。CDV是副黏病毒科麻疹病毒屬的RNA病毒，容易發生變異。近年來，新的CDV基因型不斷地出現。到目前為止，基于H基因的進化顯示CDV至少有17個不同的基因型，即America-1型（包括幾乎所有的商業現有疫苗株）、America-2～5型、Arctic-like型、Rockborn-like型、Asia-1～4型、Africa-1和2型、Europe wild型、Europe/South America-1型、South America-2和3[1，4-5]。目前，中國流行的CDV毒株主要是Asia-1型CDV[4]。H基因的多樣性也影響到了抗原性，單克隆抗體鑒定不同CDV毒株H蛋白存在抗原差異性[10-12]。本研究用CDV 851弱毒株制備的單克隆抗體2D12能區分CDV疫苗弱毒株和CDV野毒株，且對該毒株具有中和活性。考慮到H蛋白的免疫保護性和較高的抗原變異性，用桿狀病毒表達的CDV 851株H蛋白檢測與單克隆抗體2D12的反應性，結果為陽性，說明該單克隆抗體結合的是H蛋白。

CD疫苗的使用很好地控制了該病。最近在全世界包括我國，頻繁地出現CD病例，之后較大規模爆發，包括家養動物和野生動物，甚至是在接種疫苗的動物上。Li等分離的9株CDV野毒株，其中3個毒株是來自免疫犬[13]。交叉中和試驗結果表明，CDV野生型分離株之間以及CDV野生型分離株與美國目前使用的疫苗株之間存在抗原差異[14]。本研究制備的單克隆抗體與疫苗弱毒株反應而與野毒株不反應，表明單克隆抗體識別的中和抗原表位在野毒株上已經發生變異。目前CDV疫苗仍然有效，但是中和抗原表位的改變可能會降低或者減弱疫苗的免疫效率。

Chen等從15只犬中擴增到15個CDV毒株的H基因，其中9個CDV毒株屬于Asia-1型，而4個毒株與Onderstepoort毒株有著最近的關系[2]。事實上，在對NCBI中注冊的CDV毒株進行遺傳進化分析，發現很多毒株都與疫苗弱毒株有著非常近的關系[3]。臨床CDV強弱毒株無法有效鑒別，嚴重影響CDV診斷的準確性。曲叢華等建立了鑒別CDV強弱毒株的熒光定量PCR方法[15]。本研究制備的單克隆抗體能用來鑒別CDV疫苗弱毒株和流行野毒株。鑒定該單克隆抗體識別的CDV中和表位，用該表位建立間接ELISA方法可區分CDV強弱毒株感染產生的抗體，也可用該單克隆抗體建立競爭ELISA方法區分CDV強弱毒株產生的抗體，具體研究正在進行中。

H蛋白主要影響CDV的抗原性、宿主范圍和組織嗜性，其高變異率使CDV種間傳播現象加劇[16]。單克隆抗體通過不同的機制對病毒起到中和作用，如阻斷H蛋白與受體的結合，干擾H蛋白與F蛋白的結合而抑制病毒與細胞的融合以及改變病毒蛋白構象等[17]。本研究制備的單克隆抗體2D12也具有中和活性，但其具體的機制須要通過受體結合試驗、細胞融合試驗、表位鑒定等試驗來進一步研究闡明。

參考文獻：

[1]Rendon-Marin S，da Fontoura B R，Canal C W，et al. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus[J]. Virology Journal，2019，16（1）：30.

[2]Chen M，Xin T，Hou S，et al. Genotyping and pathogenic characterization of canine distemper virus based on mutations in the hemagglutinin gene in Chinese domestic dogs[J]. Polish Journal of Veterinary Sciences，2018，21（3）：623-629.

[3]周 莉，劉志杰，曾智勇，等. 犬瘟熱病毒貴州分離株H基因的克隆及其序列分析[J].動物醫學進展，2011，32（7）：19-24.

[4]Zhao J J，Yan X J，Chai X L，et al. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breeding foxes，raccoon dogs and minks in China[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（1/2）：34-42.

[5]Bi Z，Wang Y，Pan Q，et al. Development of CDV-specific monoclonal antibodies for differentiation of variable epitopes of nucleocapsid protein[J]. Veterinary Microbiology，2017，211：84-91.

[6]畢振威，王永山，范紅結. 犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因在昆蟲細胞中的表達及其抗原性分析[J].中國動物傳染病學報，2011，19（5）：21-26.

[7]畢振威. 犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備及其應用[D].南京：南京農業大學，2012.

[8]Bi Z W，Wang Y S，Wang X L，et al. Phylogenetic analysis of canine distemper virus in domestic dogs in Nanjing，China[J]. Archives of Virology，2015，160（2）：523-527.

[9]Sixt N，Cardoso A，Vallier A，et al. Canine distemper virus DNA vaccination induces humoral and cellular immunity and protects against a lethal intracerebral challenge[J]. Journal of Virology，1998，72（11）：8472-8476.

[10]Iwatsuki K，Tokiyoshi S，Hirayama N，et al. Antigenic differences in the H proteins of canine distemper viruses[J]. Veterinary Microbiology，2000，71（3/4）：281-286.

[11]Bi Z W，Xia X X，Wang Y S，et al. Development and characterization of neutralizing monoclonal antibodies against canine distemper virus hemagglutinin protein[J]. Microbiology and Immunology，2015，59（4）：202-208.

[12]Shi P，Cao Z G，Cheng Y，et al. Identification of linear B-Cell epitopes on hemagglutinin protein of canine distemper virus using two monoclonal antibodies[J]. Frontiers in Veterinary Science，2020，7：47.

[13]Li W，Cai C，Xue M，et al. Phylogenetic analysis of canine distemper viruses isolated from vaccinated dogs in Wuhan[J]. Journal of Veterinary Medical Science，2018，80（11）：1688-1690.

[14]Anis E，Holford A L，Galyon G D，et al. Antigenic analysis of genetic variants of Canine distemper virus[J]. Veterinary Microbiology，2018，219：154-160.

[15]由叢華，張傳美，張洪亮，等. 鑒別犬瘟熱病毒強弱毒株SYBR Green Ⅰ 熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫雜志，2017，53（3）：23-25.

[16]王雅文，趙建軍，閆喜軍. 犬瘟熱病毒受體及其跨宿主感染[J].病毒學報，2017，33（3）：477-482.

[17]Ader-Ebert N，Khosravi M，Herren M，et al. Sequential conformational changes in the morbillivirus attachment protein initiate the membrane fusion process[J]. PLoS Pathogens，2015，11（5）：e1004880.王大鵬，唐章生，林 勇，等. 不同投飼方式對克氏原螯蝦稻田冬繁產量和水質的影響[J]. 江蘇農業科學，2020，48（20）：183-187.