福建3類陳年老茶有機酸組分及含量比較分析

劉文靜 傅建煒 何明燕

摘要：采用反相高效液相色譜法分析比較烏龍茶、紅茶和白茶的陳年老茶中有機酸的成分及含量。茶葉樣品用純水提取后利用Titank C18色譜柱進行分離，以磷酸鹽緩沖液（pH值為2.40）-甲醇作為流動相，用二極管陣列檢測器（波長214 nm）進行檢測，柱溫為30 ℃，流速為0.8 mL/min。結果表明，10種有機酸標準曲線相關系數均在0.999 0以上，平均回收率為90.0%～96.5%，相對標準偏差≤2.1%。測得的有機酸中，10、5年陳烏龍茶、紅茶和白茶老茶中的馬來酸含量均最低。10年陳烏龍茶中含量最高的為蘋果酸，紅茶及白茶牡丹、白茶壽眉的奎尼酸含量最高，白茶貢眉中含量最高的為草酸。5年陳烏龍茶中老樅水仙、大紅袍的蘋果酸含量最高，而金佛茶中酒石酸的含量最高，功夫紅茶、白茶牡丹和白茶貢眉中含量最高的有機酸均為奎尼酸。研究還發現，在不同種類甚至同一種類不同品種的陳年老茶中，各種有機酸含量存在較大差異：在10年陳茶中，烏龍茶的草酸含量低于紅茶、白茶，而在烏龍茶中，龍鳳熟茶的馬來酸含量明顯高于其他2種烏龍茶，雞納酸含量相比最低;在5年陳茶中，烏龍茶的奎尼酸含量低于紅茶、白茶，白茶中的牡丹除草酸含量略低外，其余5種有機酸含量均高于貢眉，其中馬來酸、奎尼酸和酒石酸的含量差異在牡丹與貢眉間達極顯著水平（P<0.01）。

關鍵詞：反相高效液相色譜法;陳年老茶;有機酸組分;有機酸含量;回歸分析

中圖分類號： TS272.7? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0224-05

茶是世界三大飲料之一，因其對人體具有一定的保健功效而深受推崇。明代顧元慶在《茶譜》中記述“人飲真茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目、益思、除煩、去膩，人固不可一日無茶”[1]。由此可見，雖然古人對茶的成分并不了解，但他們已經認識到喝茶的好處及茶葉的藥用價值。研究發現，茶葉中含有茶多酚、茶氨酸、多糖、有機酸等多種活性成分。目前，關于茶葉中茶多酚[2-3]、茶氨酸[4]、多糖[5]等的報道較多，有機酸是茶葉品質成分的重要組分，在一些化學反應中常作為碳水化合物分解的中間產物，但是目前國內外關于茶葉中有機酸的分析和研究還不多[6]。

有機酸是指含有1個或多個羧基基團的有機化合物，包括芳香族有機酸與脂肪酸。目前，茶葉（湯）中已經發現的有機酸有40余種，其中茶湯中的有機酸有10余種[7]，主要有檸檬酸、綠原酸、草酸、抗壞血酸、阿魏酸及沒食子酸等，約占茶葉中干物質含量的3%[8]。有機酸參與茶樹的新陳代謝，是茶葉化學品質的主要成分之一[9]。目前，已有關于不同品種茶葉（如紅茶[10]、茯磚茶[11]、緊壓茶[12]、綠茶[13]、白茶[14]等）中有機酸檢測的研究，但未見對存放時間較長的陳年老茶中有機酸含量及成分進行比較分析的報道。

在茶葉儲藏的過程中，有機酸種類與含量的變化會對茶葉的香氣和滋味產生不同程度的影響。在長時間存放的過程中，祁門紅茶的酸類物質總量呈增加的態勢，但是各有機酸組分含量均有所改變，如草酸、乙酸等物質的含量呈增加趨勢，而檸檬酸含量下降至0.29%，其含量的降低對茶湯滋味的影響較大[15];在存儲過程中，黑毛茶的各有機酸組分含量呈波浪狀變化，無明顯規律[16]。由此可見，不同品種茶葉的陳年老茶有機酸含量具有一定差異，因此有必要對陳年老茶中的有機酸含量進行檢測分析。

本研究以從福建省各茶葉店、超市及茶廠采購的陳年老茶為研究對象，綜合前人對茶葉中有機酸含量測定方法的研究，建立反相高效液相色譜法測定老茶中有機酸組分的檢測方法，比較分析紅茶、白茶和烏龍茶等3個類型陳年老茶的有機酸含量，以期為陳年老茶的品質分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

陳年老茶，購自福建省各茶葉店、超市及茶廠。

1.2 試驗儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，購自美國Waters公司;Waters 2998二極管陣列檢測器，購自美國Waters公司;Empower色譜工作站，購自美國Waters公司;Millipore Direct-Q5超純水儀，購自美國Millipore公司;KQ5200DV超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5-A離心機，購自上海安亭科學儀器廠;HD-2500多管旋渦混合器，購自杭州佑寧儀器有限公司;pH計，購自上海埃依琪實業有限公司;微量可調移液器，購自德國Eppendorf公司。

1.3 試劑及配制

1.3.1 試劑 磷酸（分析純），購自西隴化工股份有限公司;磷酸二氫鉀（分析純），購自西隴化工股份有限公司;純度為98%的草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、雞納酸、乙酸、乳酸、馬來酸、琥珀酸、奎尼酸等，均購自上海康朗生物科技有限公司。試驗用水用Millipore Direct-Q5超純水儀制備。

1.3.2 溶液的配制 0.04 mol/L KH2PO4-H3PO4 緩沖溶液：稱取5.44 g KH2PO4，用超純水溶解并定容至1 000 mL，用85%磷酸溶液調節pH值至2.40，用0.45 μm孔徑的水相濾膜過濾，用超聲波脫氣1 min。

有機酸標準溶液的配制：準確稱取馬來酸、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、奎尼酸、雞納酸，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容，分別配制成質量濃度為5.42、5.01、5.03、540、5.30、5.03、2.06、5.07 mg/mL的標準儲備液;稱取乙酸、乳酸各5.00 g，分別置于50 mL棕色容量瓶中，用超純水溶解并定容，配制成質量濃度為100 mg/mL 的標準儲備液。將上述溶液稀釋成不同濃度，檢測并繪制各種有機酸的標準曲線，以峰面積對濃度進行線性回歸分析。

1.4 色譜條件

色譜柱型號為Titank C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;流動相：0.04 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液，pH值為2.40，流速為0.8 mL/min，柱溫為 30 ℃，進樣量為10 μL;檢測器為2998 PDA Dedector紫外檢測器，檢測波長為214 nm。

1.5 樣品處理

將茶葉磨成粉狀后稱取2.00 g置于50 mL離心管中，用超純水定容至30 mL，渦旋處理1 min，超聲提取30 min，5 000 r/min高速離心10 min。取濾液，過0.45 μm孔徑的濾膜，進樣體積為10 μL。

1.6 回收率、精密度的測定

在已知有機酸含量的茶葉樣品中添加3份不同質量濃度的有機酸混合標準液，每份質量濃度設6次平行，渦旋混勻5 min后，靜置10 min，按照“1.5”節中樣品處理方法進行處理后，再按照“1.4”節中的色譜條件進行分析，計算10種有機酸的加標回收率和精密度。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準品的色譜分析及回歸分析

如圖1所示，10種有機酸標準品在色譜分離過程中均表現出較好的峰型。

分別用各成分的峰面積（y）對應各標準工作液的質量濃度（x，μg/mL）繪制標準曲線，回歸方程、相關系數見表1。由表1可以看出，8種有機酸標準品在線性范圍內均有較好的擬合程度。

2.2 精密度與回收率

由表2可知，10種有機酸在不同質量濃度添加水平下的平均回收率均高于90.0%，并且除了雞納酸添加質量濃度為2 μg/mL時的相對標準偏差（RSD）為2.1%外，其他RSD均在2.0%以下，說明該方法具有較高的準確度與精密度，符合分析要求。

2.3 10年陳茶中有機酸含量的測定結果

由表3可以看出，各個品種陳茶中均未檢出乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸;在測得的6種有機酸中，馬來酸含量均最低;在3種烏龍茶中，含量最高的均為蘋果酸;在紅茶及白茶牡丹、白茶壽眉中，奎尼酸含量最高，在白茶貢眉中含量最高的為草酸。

對不同品種10年陳茶的有機酸含量進行比較可知，烏龍茶中的草酸含量低于紅茶、白茶，與白茶中草酸含量相比差異極顯著（P<0.01）;在3種白茶中，貢眉的草酸含量最高（290.0 mg/100 g），與其余2種白茶相比差異極顯著（P<0.01）。烏龍茶中龍鳳熟茶的馬來酸含量（10.5 mg/100 g）為所有樣品中最高的，與其他樣品差異極顯著（P<0.01）;功夫紅茶中的馬來酸含量最低（1.1 mg/100 g），但與除龍鳳熟茶外的幾種茶葉相比，差異均未達極顯著水平;3種白茶中的馬來酸含量較為接近，為2.1～3.3 mg/100 g。對不同品種茶葉中的雞納酸含量進行比較發現，烏龍茶中龍鳳熟茶的雞納酸含量低于老樅水仙和金佛，差異極顯著（P<0.01）;3種白茶中的雞納酸含量極顯著（P<0.01）低于功夫紅茶、老樅水仙和金佛，而后三者之間的差異不顯著，可見白茶相比于烏龍茶、紅茶，其雞納酸含量較低。同類但不同品種的陳年老茶中的蘋果酸含量表現出較大差異，烏龍茶中金佛的蘋果酸含量（493.1 mg/100 g）最高，其次為老樅水仙的蘋果酸含量（292.8 mg/100 g），龍鳳熟茶的蘋果酸含量（165.8 mg/100 g）最低，它們之間的差異均達極顯著水平（P<0.01）;白茶中壽眉的蘋果酸含量最高（304.6 mg/100 g），與牡丹、貢眉相比差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）;功夫紅茶的蘋果酸含量（348.7 mg/100 g）僅次于烏龍茶中金佛的蘋果酸含量，高于所有白茶的蘋果酸含量。對茶葉樣品中奎尼酸含量的檢測結果表明，龍鳳熟茶中的奎尼酸含量（46.5 mg/100 g）遠低于其他樣品（P<0.01）;功夫紅茶中的奎尼酸含量最高（486.6 mg/100 g），為龍鳳熟茶的10倍以上。在3種烏龍茶中，老樅水仙的酒石酸含量最低（31.9 mg/100 g），與白茶貢眉（33.2 mg/100 g）相當，而其余2種烏龍茶（龍鳳熟茶和金佛）中的酒石酸含量接近，分別為152.6、152.3 mg/100 g，遠高于其他茶葉樣品中的酒石酸含量（P<0.01）;白茶牡丹、壽眉和功夫紅茶的酒石酸含量差異不顯著。

2.4 5年陳茶中有機酸含量的測定結果

由表4可知，與10年陳茶一致，在所有茶葉樣品中均未檢出乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸;在檢出的6種有機酸中，馬來酸含量均最低;在各茶葉品種中，5年陳茶中含量最高的有機酸與10年陳茶中略有不同。在烏龍茶中，老樅水仙、大紅袍的蘋果酸含量最高;而在2種金佛茶中，酒石酸含量最高;在功夫紅茶、牡丹、貢眉中，含量最高的均為奎尼酸。

對不同品種5年陳茶的有機酸含量比較可知，烏龍茶中的金佛（散茶）、金佛（茶餅）和大紅袍的草酸含量較低，相比含量最高的2種白茶（牡丹、貢眉），草酸含量的差異達極顯著水平（P<0.01）;在烏龍茶中，老樅水仙的草酸含量也低于其他2種白茶，差異顯著（P<0.05）。在功夫紅茶中，馬來酸含量（0.7 mg/100 g）最低，而白茶中牡丹的馬來酸含量最高（10.2 mg/100 g），與其他樣品相比差異均極顯著（P<0.01）。

功夫紅茶的雞納酸含量（56.6 mg/100 g）極顯著高于其他茶葉樣品（P<0.01）;白茶中的雞納酸含量較低，極顯著低于烏龍茶老樅水仙和大紅袍（P<0.01），但與烏龍茶金佛（散茶）、金佛（茶餅）間的差異不顯著。金佛（茶餅）中的蘋果酸含量最低，其余樣品中的蘋果酸含量略有差異，但差異未達極顯著水平。功夫紅茶中的奎尼酸含量最高（557.8 mg/100 g），其次為白茶牡丹（474.9 mg/100 g），二者的奎尼酸含量均極顯著高于烏龍茶（P<0.01）;烏龍茶中金佛（散茶）、金佛（茶餅）和大紅袍的酒石酸含量則極顯著高于紅茶和白茶（P<0.01）。

3 討論與結論

目前關于茶葉中有機酸的研究相對較少，本研究綜合前人對茶葉中有機酸含量測定方法的研究，建立了測定5、10年陳茶中有機酸含量的反相高效液相色譜法。結果顯示，檢測獲得的各類有機酸標準品具有較高的分離度，線性回歸方程的相關系數均>0.999，回收率在90.0%及以上，且RSD≤21%，說明該方法具有較好的回收率及精密度。由于茶葉復雜的成分對有機酸測定具有較大干擾作用，因而用本試驗中的方法未能定量檢測出茶葉中的琥珀酸、乙酸、檸檬酸和乳酸。

制茶工藝對茶葉中的有機酸含量具有一定影響。謝旻皓等研究發現，發酵體系中的微生物對于提高有機酸代謝產物含量具有一定作用[17];屠幼英等研究發現，經微生物發酵的茶葉中的總有機酸量大于非發酵茶[18]。紅茶屬于全發酵茶，烏龍茶屬于半發酵茶，白茶屬于微發酵茶，由此可以推測，茶葉中有機酸含量的差異可能與其工藝中的發酵過程有關。本研究通過檢測發現，在不同種類甚至同一種類、不同處理的陳年老茶中，各種有機酸含量存在較大差異，10年陳烏龍茶中的草酸含量低于紅茶、白茶;此外，烏龍茶中龍鳳熟茶的馬來酸含量明顯高于其他2種烏龍茶，而雞納酸含量相比最低。在5年陳老茶中，烏龍茶的奎尼酸含量相對低于紅茶、白茶;白茶中的牡丹除草酸含量略低外，其余5種有機酸含量均高于貢眉，其中馬來酸、奎尼酸和酒石酸含量的差異均達極顯著水平（P<0.01）。

茶葉在陳化過程中，部分大分子物質逐漸氧化、降解，一些小分子物質會聚合或氧化，各種色素物質和呈味物質產生重組，從而表現出與新茶不同的感官品質[19]。劉盼盼等研究不同葉位、不同品種和不同種類茶葉中的有機酸含量發現，有機酸含量隨著鮮葉嫩度的下降而降低[8];趙和濤研究發現，紅茶經過萎凋、揉捻、發酵等加工工序后，有機酸總量呈增長趨勢，直至干燥時才有所降低[20]。謝嬌枚等對祁門紅茶進行品質分析發現，在長時間的存放過程中，祁門紅茶的酸類物質總量明顯增加，但是各有機酸組分含量均有所改變[15]。本研究通過檢測5、10年陳茶中的有機酸，未發現有機酸含量與貯藏年份的相關性，推測其原因，主要由于檢測的2種年份的茶不是同一批次貯藏的，同時部分茶葉樣品在貯藏過程中經過了復焙，因此隨貯藏年份變化，有機酸含量未發現明顯的變化規律。

茶葉陳化后的品質表現與原料品質、環境條件及貯存時間等多方面的因素有關[21]，國內關于對茶葉陳化機制的研究還很有限，需要大量試驗與分析來驗證陳年老茶越陳越香的確切標準。有機酸作為茶葉重要的成分之一，對其定性與定量分析是陳年老茶品質調控必不可少的內容，具有重要意義。

參考文獻：

[1]劉 欠，劉雅璇，肖 娟，等. 茶葉美容護膚作用機制及應用研究進展[J]. 中國醫藥導報，2018，15（33）：40-42.

[2]Yang C S，Li G，Yang Z，et al. Cancer prevention by tocopherols and tea polyphenols [J]. Cancer Letters，2013，334（1）：79-85.

[3]楊金偉，楊 斌.茶多酚提取工藝影響因素探究[J]. 云南化工，2019，46 （3）：108-109.

[4]龍成梅，曾承露.超聲波提取都勻毛尖茶中茶氨酸的工藝研究[J]. 廣州化工，2019，47（16）：102-104.

[5]宋林珍，朱麗云，高永生，等. 茶多糖的結構特征與降血糖活性[J]. 食品科學，2018，39（19）：162-168.

[6]何水平，郭春芳，孫 云.茶葉有機酸的研究進展[J]. 亞熱帶農業研究，2015，11（1）：63-67.

[7]譚和平，葉善蓉，陳 麗，等. 茶葉中有機酸的測試方法概述[J]. 中國測試技術，2008，34（6）：77-80.

[8]劉盼盼，鐘小玉，許勇泉，等. 茶葉中有機酸及其浸出特性研究[J]. 茶葉科學，2013，33（5）：405-410.

[9]章劍揚，劉 新，車金水，等. 快速溶劑萃取-離子色譜法測定茶葉中的有機酸[J]. 化學分析計量，2012，21（1）：43-45.

[10]張 靜，蔣華軍，劉仲華，等. 親水性C18硅膠反相色譜柱同時分離測定紅茶中的有機酸[J]. 食品安全質量檢測學報，2014，5（8）：2476-2481.

[11]袁 玲，黃建安，龔志華，等. 茯磚茶有機酸反相高效液相色譜分析方法建立及其應用[J]. 中國農學通報，2011，27（30）：246-252.

[12]丁 玲，屠幼英，陳曉敏.高效液相色譜測定緊壓茶中有機酸條件研究[J]. 茶葉，2005，31（4）：224-227.

[13]陸 敏，張紹巖，于宏偉，等. 綠茶毛尖中有機酸的高效液相色譜分析[J]. 廣東農業科學，2012，39（2）：86-87.

[14]Marat T，張 釬，屈艷勤，等. 白茶加工過程中有機酸組分含量分析[J]. 福建茶葉，2019（3）：11-12

[15]謝嬌枚，羅敏燕，劉易凡，等. 陳年祁門紅茶品質分析[J]. 湖南農業科學，2012（11）：100-102，105.

[16]謝嬌枚.黑毛茶存放過程中品質化學研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2013.

[17]謝旻皓，王晴川，徐冬蘭，等. 苦丁茶冬青苦丁茶提取物與3，5-雙咖啡酰奎尼酸對腸道微生物體外發酵的影響[J]. 食品科學，2015，36（17）：124-129.

[18]屠幼英，梁慧玲，陳 暄，等. 緊壓茶兒茶素和有機酸的組成分析[J]. 茶葉，2002，28（1）：22-24.

[19]諶 瀅，李 適，劉仲華，等. 黑茶陳化機制研究進展[J]. 湖南農業科學，2016（12）：118-122.

[20]趙和濤.紅茶加工中有機酸代謝及對茶葉香氣形成的影響[J]. 茶葉通訊，1993（1）：25-27.

[21]劉霞林.茶葉陳化機理及保鮮技術研究進展[J]. 茶葉通訊，1998（4）：24-26. 李 沁，夏 菁，施 蕊，等. 辣木葉低極性組分的分離純化和GC-MS分析[J]. 江蘇農業科學，2020，48（20）：229-233.