昆蟲體液免疫負向調控因子的研究進展

趙 磊， 段旭彤， 王夏璐， 鄒積宏*

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心， 黑龍江 哈爾濱 150500; 2.黑龍江大學 生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080; 3.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016; 4.沈陽藥科大學 醫療器械學院，遼寧 沈陽 110016)

昆蟲在自然界中分布廣泛，種類繁多，不具備獲得性免疫而僅依賴進化保守的先天性免疫應答抵御病害，從而維持機體自身的平衡[1]。昆蟲先天性免疫系統由體液免疫和細胞免疫組成。其中，體液免疫主要包括由酚氧化酶原激活系統(Prophenoloxidase activating system, PPO-AS)介導的黑化反應及由Toll、免疫缺陷(immune deficiency, IMD)、JAK/STAT等信號通路介導的抗菌肽合成；細胞免疫包括由血細胞參與的吞噬、包囊、結節形成等。2種免疫反應相輔相成、協同合作，共同防御真菌、病毒、細菌等病原微生物的侵染[2-3]。

隨著對昆蟲先天性免疫系統了解的不斷深入，研究發現，免疫應答反應強烈的昆蟲有時會出現腸道菌群紊亂、神經退變、生存期縮短等現象[4-5]。究其原因，發現與昆蟲免疫應答的過度激活相關。以PPO-AS介導的黑化反應為例，當病原體入侵誘導昆蟲體內PPO-AS激活后，適量產生的黑色素可將入侵病原體包裹起來以防止其在昆蟲體內擴散和繁殖，并通過形成的黑色素將病原菌殺死，對機體起到保護作用。當黑化反應過度激活時，過量產生的奎寧等物質將對昆蟲自身的組織功能造成損傷，甚至導致死亡[6]。因此，昆蟲免疫應答的激活強度和持續時間必須受到嚴格和精密的調控。近年來，昆蟲免疫負向調控機制及其相關調控因子逐漸成為免疫學研究的熱點。目前，已發現并鑒定出多種昆蟲免疫負向調控因子，根據調控的不同免疫階段，從絲氨酸蛋白酶級聯放大系統的負向調控、昆蟲體液免疫蛋白類效應分子合成與降解的負向調控和昆蟲體液免疫模式識別過程的負向調控3個方面對昆蟲體液免疫負向調控因子的研究進展進行了概述，以期為昆蟲免疫防御的調控研究及應用提供理論基礎。

1 絲氨酸蛋白酶級聯系統的負向調控

絲氨酸蛋白酶級聯放大系統是由昆蟲體內游離的絲氨酸蛋白酶(Serine proteases，SPs)逐級激活形成的級聯放大系統，激活迅速、反應靈敏。當SPs級聯系統被激活后，微弱的病原體入侵信號被級聯反應快速放大并向下游傳遞，末端活化的絲氨酸蛋白酶或剪切無活性的酚氧化酶原(Prophenoloxidase，PPO)為有活性的酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)，催化黑色素的產生，抵御病原體的入侵；或通過激活Toll通路誘導抗菌肽的生成以消滅病原菌[7]。而靶向絲氨酸蛋白酶的抑制劑則在此過程中通過調控SPs的活性，將免疫反應限定在一個安全的范圍內，避免了宿主的過度免疫。研究發現，靶向絲氨酸蛋白酶的抑制劑有絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine proteinase inhibitors，Serpins)和Kunitz型蛋白酶抑制劑(Kunitz-type protease inhibitors，KPIs)。

1.1 絲氨酸蛋白酶抑制劑

1.1.1 Serpins結構特點與作用機制 Serpins是蛋白酶抑制劑中數量最多的一個家族。根據其功能不同可分為抑制型Serpins和非抑制型Serpins。其中，抑制型Serpins具有相似的結構特征，通常由350～500個氨基酸組成，分子量約40～50 kDa，其結構主要由保守的蛋白主體(α螺旋、β-折疊)及具有靶酶特異性識別位點(P1)的反應中心環(reactive center loop，RCL)組成[8]。抑制型Serpins不僅結構相似，對絲氨酸蛋白酶的抑制機制也大致相同。通常情況下，蛋白酶可與Serpins RCL上的剪切位點(P1-P1’)結合，形成過渡態米氏復合物。隨后，RCL上P1端的氨基酸與蛋白酶之間形成共價鍵，導致P1-P1’間的肽鍵斷裂，經過系列結構變化，最終形成穩定的Serpin-蛋白酶復合物，通過致使靶酶失活而發揮抑制作用，這種作用機制即被稱為自殺性抑制[9]。

1.1.2 Serpins對昆蟲體液免疫的負向調控作用 目前，已在昆蟲中鑒定出1 500余種Serpins超家族成員，大多數Serpins主要功能是抑制絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶的活性，進而參與昆蟲免疫應答的負向調控過程。但非抑制型Serpins則不具有自殺性抑制絲氨酸蛋白酶活性的功能，通常作為儲藏蛋白、激素的前體、激素轉運體及輔助蛋白折疊的分子伴侶等行駛生理功能[10-11]。目前，Serpins針對生理發育的相關功能已在絕大多數昆蟲中得到廣泛研究，但其免疫相關功能僅在果蠅、煙草天蛾和黃粉蟲等少數昆蟲中較為明確。研究發現，Serpins主要通過抑制昆蟲絲氨酸蛋白酶級聯放大系統特定游離靶酶的活性進而對體液免疫應答起負向調控作用。

在果蠅中發現多種Serpins參與調節先天性免疫應答。其中，Serpin-77Ba可以抑制PPO-AS中黑化作用蛋白酶MP1和MP2的活性，從而抑制黑色素的形成；Serpin-27A通過與酚氧化酶原激活酶(prophenoloxidase-activating enzyme，PPAE)共價結合來抑制黑化反應；Serpin-28D可抑制PPO的剪切激活從而抑制PPO-AS，Serpin43Ac與Toll途徑負調控相關[12-15]。

在黃粉蟲中，病原體分子模式和模式識別蛋白復合體激活模塊化絲氨酸蛋白酶(Modular serine protease，MSP)后，向下順序激活Sp?tzle激活酶(Sp?tzle activating enzyme，SAE)和Sp?tzle加工酶(Sp?tzle-processing enzyme，SPE)[16]。SPE作為此通路的末端絲氨酸蛋白酶，不僅可直接激活Pro-Sp?tzle，活化的Sp?tzle與細胞膜受體Toll結合，促使Toll信號傳導途徑的激活；還可剪切活化PPO，誘導PPO-AS的激活，形成黑化反應?，F已研究證實，Serpin-40、-55和-48可分別與上述絲氨酸蛋白酶形成共價復合物，即Serpin-40/MSP、Serpin-55/SAE和Serpin-48/SPE，通過抑制三步絲氨酸蛋白酶級聯反應對Toll信號傳導途徑和PPO-AS起到負向調控作用。

在煙草天蛾中，已發現10余種抑制型Serpins。其中，Serpin-1J不僅通過抑制血淋巴蛋白酶HP8的活性降低Toll信號傳導通路的激活程度，還可與酚氧化酶原激活酶PAP-1和PAP-3共價結合，對PPO-AS起到負向調控作用；Serpin-3能通過抑制PAP-1和PAP-3的活性來負向調控PPO的剪切激活；Serpin-4和Serpin-5對HP6均具有抑制作用，且Serpin-4還可抑制HP21的活性進而負向調控PPO-AS的激活；Serpin-6和Serpin-7可抑制PAP-3的活性從而對煙草天蛾的黑化反應起到負向調控作用；Serpin-6和Serpin-9能夠與HP8共價結合，通過抑制Toll通路抑制抗菌肽的合成；Serpin-9和Serpin-13通過封閉SPs級聯反應中的HP6活性抑制PPO-AS和Toll通路的激活；Serpin-12則可與HP14共價結合進而抑制PPO的激活，目前，煙草天蛾中僅Serpin-2尚未發現具有免疫相關功能[17-20]。

隨著研究的深入，Serpins在其他鱗翅目昆蟲物種中的免疫相關功能也被陸續被發現。如，家蠶中，Serpin5通過與HP6和SP21形成復合物，抑制PPO-AS和Toll通路的活性；Serpin-32通過抑制PAP-3的剪切激活從而抑制黑化反應的發生；Serpin6和Serpin15均能抑制PPO的活化和抗菌肽的表達，Serpin28則抑制抗菌肽的合成，但其具體的作用機制尚不可知[21-25]。柞蠶Serpin-6和Serpin-14可抑制其體內的黑化反應，調控由病原體侵染介導機體的免疫激活程度[26-27]。柞蠶Serpin-3在抑制PPO激活的同時，還可以抑制Toll通路的關鍵蛋白Sp?tzle及多種抗菌肽的產生[7]。但目前家蠶及柞蠶等昆蟲中多數Serpins的靶酶尚未確定。此外，CHU等[28]在亞洲玉米螟中克隆得到Serpin-3 cDNA全序列的研究表明，其與絲氨酸蛋白酶SP13形成復合物，從而抑制真菌誘導的PPO-AS及抗菌肽的表達。另一方面，YUAN等[29]在棉鈴蟲中利用蛋白質組學和免疫印跡分析發現，在桿狀病毒感染后，Serpin-5及Serpin-9的表達量升高，說明其與病毒介導的免疫應答相關；進一步試驗證明，Serpin-5和Serpin-9分別通過抑制絲氨酸蛋白酶cSP4和cSP6來調節黑化反應進而抑制病毒感染。

1.2 Kunitz型蛋白酶抑制劑

1.2.1 KPIs結構特點與作用機制 KPIs是動植物在長期進化過程中所形成的一類抑制性多肽，因1945年由Kunitz首次從大豆中分離而得名，在昆蟲的生存和發育過程中具有重要作用。KPIs家族成員的氨基酸序列同源性較高，空間結構相對較保守，通常含有一個獨特的Kunitz結構域，由2對或3對高度保守的二硫鍵維持蛋白的空間結構，但也有部分KPIs只有1對甚至不含有二硫鍵，推測其依賴氫鍵來維持結構的穩定[30-31]。KPIs通常呈β-三葉草形狀，其抑制中心突出于三維結構的表面且可通過深入到靶酶的底物口袋，形成穩定的靶酶-抑制劑復合物來封閉靶酶的活性中心，從而抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的活性[32]。

1.2.2 KPIs對昆蟲體液免疫的負向調控作用 迄今為止，在昆蟲中已發現多種KPIs。RAMESH 等[33]從煙草天蛾中鑒定出2種KPIs(HLTIs A和B)，其不僅可以抑制血淋巴中PPO的激活，還可保護昆蟲免受入侵寄生蟲所分泌的蛋白酶所侵害。蓖子硬蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑IrSPI也是一種Kunitz型抑制劑，其可降低T淋巴細胞的增殖能力及促炎細胞因子的分泌，從而調節宿主的免疫應答反應[34]。亞洲璃眼蜱11 kDa蛋白HA11具有抗凝血的作用，相同現象也在果蠅中被發現；用細菌或真菌感染果蠅，可使其體內兩種KPIs的表達量增加，說明KPIs具有免疫相關性，可能參與果蠅的免疫應答[35-36]。盡管上述KPIs凝血作用的抗凝作用機制目前還不明確，但可以此為基礎開發新型的抗凝藥物和防治寄生蟲疫苗。此外，美洲鉤蟲中發現的NaKuI3可通過抑制絲氨酸蛋白酶的活性進而抑制宿主的炎癥反應和免疫應答[37]。當變異革蜱中被立克次氏體感染時，KPI在中腸的表達量持續增加，體外試驗也證明變異革蜱中的KPI可影響小鼠成纖維細胞的立克次氏定殖，推測這可能與KPIs胰蛋白酶抑制能力有關[38]。

2 昆蟲體液免疫蛋白類效應分子合成與降解的負向調控

2.1 對IMD通路的負向調控

對昆蟲免疫效應分子合成的抑制也是針對體液免疫負向調控的重要手段之一。胡杰等[39]從家蠶中鑒定得到的Caspase-8-Like蛋白可通過抑制家蠶轉錄因子Relish的切割，通過負調控IMD信號通路來抑制抗菌肽基因(如Cecropin A1)的表達。在果蠅中發現2種可能對IMD通路具有負調控作用的因子：一是鋅指同源結構域zfh1，當敲除果蠅S2細胞中的zfh1后，IMD通路介導的抗菌肽Cecropin B表達量增加，但Toll通路介導的Drosomycin表達卻不受影響[40]；二是潛在的免疫效應分子合成負向調控因子是Morris等在果蠅中發現的一種I κB超家族蛋白Pickle，其可通過與Relish和組蛋白去乙酰化酶dHDAC1相互作用，抑制IMD通路的過度激活。但當Toll和IMD通路同時激活時，Pickle只影響由RelN驅動的抗菌肽的誘導[41]。目前，上述2因子的負向調控具體機制尚不清楚。

2.2 泛素化和去泛素化酶的負向調控

平衡泛素化和去泛素化之間的關系對調節昆蟲免疫信號通路尤為重要?，F已研究證實：一些泛素化和去泛素化酶對體液免疫效應分子的轉錄過程具有負調控作用。例如，果蠅中的去泛素酶Trabid可與TAK1相互作用，降低免疫信號輸出和k63連接的泛素化，從而抑制IMD信號通路[42]；去泛素化酶Fas相關因子(Fas associated factor，FAF)可誘導IMD的多泛素化，從而抑制IMD通路中抗菌肽Diptericin的表達[43]。而家蠶FAF則通過與Relish結合并促進其降解，最終抑制IMD信號通路的激活[44]。

3 昆蟲體液免疫模式識別過程的負向調控

模式識別受體對外來入侵者的免疫識別被認為是啟動先天性免疫系統進而產生信號傳導的“開門磚”，但也有研究表明，一些模式識別受體不僅能識別病原菌表面的模式分子介導免疫反應的激活，還可通過抑制其他模式識別受體的模式識別能力的方式對昆蟲體液免疫起到負向調節作用。然而關于模式識別過程負向調節昆蟲免疫的研究甚少，目前僅對肽聚糖模式識別蛋白(Peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)超家族成員參與調控體液免疫應答的研究相對較為清楚。果蠅體內存在多種PGRPs，根據分子量大小將其分為長型和短型PGRPs，即：PGRP-Ls和PGRP-Ss。多數果蠅PGRPs可通過識別入侵細菌表面的典型PAMP-PGN啟動先天性免疫應答，但也有一些PGRPs卻對體液免疫信號通路起到抑制作用。例如，PGRP-LF可與Imd途徑的主要跨模型PRR-PGRP-LC形成異二聚體，通過阻止PGRP-LC識別PGN進而負向調控由Imd途徑介導的抗菌肽轉錄[45]；此外，PGRP-LB、-SB和-SC還可利用其自身酰胺酶活性促使PGN裂解，通過降低入侵PGN的激活濃度進而下調PGRP-LC模式識別的方式抑制Imd通路的激活[46-47]。

4 問題與展望

4.1 問題

多樣的免疫負向調控因子及其精準的調控機制是昆蟲既能抵御病原微生物入侵威脅又能正常生理發育的重要保障。雖目前已在昆蟲免疫抑制劑研究方面取得了階段性進展，但有關昆蟲體液免疫負向調控的相關理論仍有許多問題尚不清楚。具體內容可分為如下幾方面：

首先，絲氨酸蛋白酶級聯系統是PPO-AS介導的黑化反應，是由Toll、IMD途徑介導的抗菌肽合成兩大體液免疫反應胞外激活途徑的重要組成部分。目前已鑒定出許多具有針對上述級聯系統的Serpins類和KPIs類免疫抑制劑，但有關兩者的研究尚不夠深入。就Serpins而言，除黃粉蟲和煙草天蛾外，絕大多數昆蟲體內發現的Serpins參與調控的具體免疫信號通路及其共價抑制的靶酶類型仍不清楚。而作為發現數量僅次于Serpins的KPIs類抑制劑，絕大多數相關研究尚處于免疫抑制現象發現階段，目前尚無明確闡述其抑制靶酶、參與調控體液免疫應答的類型及調控具體分子機制的相關研究報道。

其次，對入侵病原體的模式識別是啟動昆蟲免疫應答的物質基礎，“病原體-模式識別受體”復合物的形成數量及親和力大小直接決定激活免疫反應的強度和時間，所以針對模式識別過程的抑制因子也可被認為是一種有效的昆蟲免疫抑制劑。然而，目前這部分內容的相關研究甚少，但由果蠅PGRPs的研究結果可以推測：昆蟲體內的某些模式識別受體可能在特定情況下也充當“免疫抑制劑”的角色。

最后，信號通路激活所產生的免疫效應分子是清除入侵病原體的直接殺傷利器。抑制免疫效應分子的數量及其活性也屬于免疫反應負向調節的一種有效方式，但目前針對此部分內容的研究幾乎空白。其中，針對抗菌肽合成抑制劑的相關研究，可將重點鎖定在介導抗菌肽激活的Toll、IMD和JAK/STAT途徑胞內信號傳導通路，發現并鑒定的細胞核中針對抗菌肽轉錄具有抑制作用的細胞因子；而針對抗黑色素形成相關抑制劑的研究，則需在深入了解黑色素形成的機制并鎖定其形成所必需的關鍵物質基礎上，尋找體液中針對各種關鍵蛋白的抑制劑。

4.2 展望

抗病蟲害一直是動植物科學領域的熱門研究話題，目前已研制出多種有效的農業和畜牧業殺蟲劑，但這些產品由不同的活性成分組成，大多數活性成分為化學物質，此類藥物雖殺蟲效果良好，但藥物殘留、環境污染、耐藥性等問題也日益突出。因此，尋找并研發新型無害無污染殺蟲劑成為了當今抗病蟲害研究的新目標。而昆蟲體液免疫負向調控因子的蛋白質屬性、無害性及對免疫系統抑制作用的有效性為研發新型、無污染、生物制品類殺蟲劑開辟新思路。例如，將昆蟲Serpin的編碼基因利用基因工程手段導入昆蟲病原真菌——白僵菌中，以表達昆蟲Serpin的白僵菌作為殺蟲劑感染昆蟲，高效表達的Serpin可有效抑制宿主昆蟲的免疫反應以保證白僵菌在宿主昆蟲中的有效繁殖，最終達到殺死宿主昆蟲的目的[15]。此外，目前KPIs在抗凝血、抗腫瘤等方面的研究成果也適合用于研制人類的抗凝藥物及防治寄生的昆蟲疫苗等。

簡而言之，負向調控因子在昆蟲免疫反應調節和維持免疫穩態方面起到極其重要的作用，開展針對昆蟲負向調控因子及其調控分子機制的研究，不僅能為深入了解昆蟲免疫信號通路及其調節機制提供理論依據，同時，也能為研發適用于農業、畜牧業、醫療等應用領域相關制品提供必要的理論依據和物質基礎。