蘆丁對肝細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制

金芳多, 張 天, 張 釗, 尹學哲, 全吉淑

（延邊大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 延吉 133002）

氧化應激損傷是肝損傷發生過程中的重要機制和 環 節［1］。 叔 丁 基 過 氧 化 氫 （tert-butyl hydroperoxide， TBHP） 是一種較穩定的氧化劑，通常用于體內外誘導氧化應激損傷，本研究利用TBHP 建立人肝癌HepG2 細胞的氧化損傷模型。蘆丁是從植物中提取的天然黃酮類化合物，是天然的抗氧化劑，具有抗氧化、抗自由基、舒張血管、神經保護和保肝等多種藥理作用［2-3］。蘆丁作為傳統的中草藥，近年來引起國內外學者的廣泛關注，因其具有強烈的抗氧化性和較少的不良反應，被廣泛應用于臨床中，目前主要用于治療高血壓、糖尿病和心血管疾病等。既往研究［4］顯示：蘆丁可以通過調節信號通路、抑制腫瘤細胞生長和誘導細胞凋亡發揮其抗腫瘤作用，有研究［5］顯示：蘆丁能增加磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinositol 3 kinase，PI3K）、蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR） 信號通路的活化程度， 并能通過增加抗氧化應激酶的表達來進一步降低氧化應激的水平，對神經細胞、胃癌細胞和心肌細胞等均有一定的保護作用，但有關蘆丁抑制肝細胞氧化損傷的作用及其機制尚缺乏深入的系統性研究。本研究通過探討蘆丁對肝細胞氧化損傷的保護作用，為蘆丁的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2 細胞購自延邊大學附屬醫院細胞庫提供。蘆丁購自阿拉丁試劑公司， 高糖DMEM 培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gemini 公司，胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich 公司， 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl terrazolium， MTT） 購 自 美 國Sigma-Aldrich 公 司， 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA） 試劑盒、 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD） 試劑盒和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione， GSH） 試劑盒購自南京建成科 技 有 限 公 司， 活 性 氧 （reactive oxidative species， ROS） 檢測試劑盒購自廣州碧云天生物技術有限公司，PI3K 抗體、Akt 抗體和核轉錄因子κB （nuclear factor kappa B， NF-κB） 抗體、 腫瘤抑制基因p53 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。 酶標儀購自深圳雷杜公司，IX70-7721 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司，DYCZ-24DN 電泳儀購自北京市六一儀器廠，UVP凝膠成像儀購自美國UVP 公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.2肝癌HepG2細胞培養和分組取增殖活躍并處于對數生長期的肝癌HepG2 細胞，將其分為對照組、TBHP 組和0.25、0.50、1.00 μmol·L－1蘆丁組。對照組細胞常規培養，TBHP 組細胞加入含終 濃 度 為400 μmol·L－1TBHP 的 無 血 清 培 養 液，培養細胞4 h，建立氧化損傷模型；0.25、0.50 和1.00 μmol·L－1蘆丁組先分別使用含0.25、0.50 和1.00 μmol·L－1蘆丁的培養液預處理24 h （蘆丁用DMSO 預溶，DMSO 體積不超過總體積的0.3%，采用DMEM 培養液稀釋至所需的溶液濃度），再采用含400 μmol·L－1TBHP 的無血清培養液培養細胞4 h。

1.3 MTT法檢測各組肝癌HepG2細胞活性將細胞接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，換入含蘆丁的無血清培養液，使其濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00 和4.00 μmol·L－1，并設置對應的空白對照組。對照組添加無血清培養液，空白對照組添加不含細胞的培養液。作用細胞24 h 后，棄去上清。每孔加入20 μL MTT 溶液。MTT 溶液作用細胞4 h 后，吸取上清，每孔依次加入150 μL DMSO溶液，混勻溶解，待生成的藍紫色結晶完全溶解后，置于酶標儀492 nm 波長處測得各組吸光度（A） 值，計算細胞活性。細胞活性= （實驗孔A 值－實驗空白孔A 值） ／ （對照孔A 值－空白對照孔A 值） ×100%。實驗重復3 次。

1.4 MTT法檢測各組肝癌HepG2細胞存活率將細胞接種于96 孔板中，按照上述實驗分組分為對 照 組、 TBHP 組和0.25、 0.50、 1.00 μmol·L－1蘆丁組，并對各個實驗組設置空白對照。細胞按上述方法處理后，吸取上清，每孔加入20 μL MTT溶液， 作用細胞4 h 后， 吸 取 上 清， 每 孔 加 入150 μL DMSO 溶液，振蕩混勻，待生成藍紫色結晶并完全溶解后，置于酶標儀492 nm 波長處測得各組A 值。細胞存活率＝（實驗孔A 值－實驗空白孔A 值） ／ （對照孔A 值－空白對照孔A 值） ×100%。實驗重復3 次。

1.5比色法檢測各組肝癌HepG2細胞中MDA和GSH水平及SOD活性按上述實驗方法處理細胞后，棄去原上清培養液，胰酶消化細胞，將培養液在室溫條件下1 000 r·min－1，離心10 min 并收集細胞沉淀，在細胞沉淀中加入0.5～1.0 mL 等滲磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution， PBS），在室溫條件下離心10 min 沉降細胞。棄上清，留細胞沉淀。加入0.5～1.0 mL PBS，冰水浴下手動勻漿破碎細胞3 min，取破碎后細胞勻漿液待用，后按試劑盒說明書步驟進行操作。計算方法：MDA 水平（μmol·L－1） = （測定管A 值－測定空白管A 值） /（標準管A 值－ 標準空白管A 值） × 標準品濃度（10 μmol·L－1） × 樣 本 稀 釋 前 倍 數； SOD 活 性（U·mL－1） = （對照管A 值－測定管A 值） /（對照管A 值） /50%×反應體積的稀釋倍數×樣本測試前的稀釋倍數； GSH 水平（μmol·g－1） = （測定 孔A 值－ 空 白孔A 值） / （標 準 孔A 值－ 空 白孔A 值） ×樣本前處理稀釋倍數（2 倍） /待測勻漿蛋白濃度（g·L－1）。實驗重復3 次。

1.6熒光顯微鏡檢測各組肝癌HepG2細胞中ROS水平將細胞接種于6 孔板中， 分組處理方法同“1.2” 步驟。按照1∶1 000 的比例采用無血清培養液 稀 釋DCFH-DA， 使 其 終 濃 度 為10 μmol·L－1，去除細胞培養液，每孔加入1 mL DCFH-DA 稀釋液，置于37℃培養箱孵育20 min，以裝載探針，然后采用無血清細胞培養液洗滌細胞3 次， 每孔1 mL，去除細胞中殘留的DCFH-DA，置于熒光顯微鏡下采用488 nm 激發波長和525 nm 發射波長觀察細胞形態表現，以細胞中綠色熒光強度表示ROS 水平。

1.7 Western blotting法檢測各組肝癌HepG2細胞中相關蛋白表達水平按照 “1.2” 步驟中方法進行分組和給藥，藥物作用完畢后收集細胞。提取細胞總蛋白后，采用BCA 法測定蛋白濃度。配置濃縮膠和10% 分離膠進行電泳分離蛋白，統一蛋白上樣量20 μg，電轉移至聚偏乙烯PVDF 膜上，轉膜過后， 采用含5% 脫脂奶粉的TBST 封閉2 h。采用TBST 洗脫PVDF 膜，加入一抗孵育4℃過夜。次日經TBST 洗脫抗體后，置于二抗中室溫孵育1～2 h，然后采用TBST 洗脫PVDF 膜。并將膜浸泡于顯影液中顯影曝光，UVP 凝膠成像分析儀中采集圖像，采用Image J 進行灰度分析，以β-actin作為內參對照， 計 算 PI3K 、 磷 酸 化 PI3K（ p-PI3K）、 Akt、 磷 酸 化Akt （p-Akt）、 NF- κB、磷酸化NF-κB （p-NF-κB） 及p53 蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8統計學分析采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析。各組HepG2細胞存活率、肝癌HepG2 細胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性以及HePG2 細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋 白 表達水平均符合正態分布，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組HepG2細胞活性當蘆丁摩爾濃度≤1.00 μmol·L－1時，HepG2 細胞的存活率均＞90%，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；蘆丁摩爾濃度＞1.00 μmol·L－1后，細胞存活率逐漸降 低。 因此本實驗選取0.25、0.50和1.00 μmol·L－1蘆丁作為后續實驗的干預劑量。見圖1。

2.2各組肝癌HepG2細胞存活率與對照組比較， TBHP 組肝癌HepG2 細胞存活率明顯降低，接近半數抑制率（P＜0.01）；與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組肝癌HepG2 細胞存活率逐漸升高，1.00 μmol·L 蘆 丁 組 肝 癌HepG2 細 胞 存 活 率 最 高（P＜0.01）。見表1。

圖1 各組肝癌HepG2 細胞活性Fig.1 Cell vitalities of liver cancer HepG2 cells in various groups

表1 各組肝癌HepG2 細胞存活率Tab.1 Survival rates of liver cancer HepG2 cells in viarous groups （n=3±s）

表1 各組肝癌HepG2 細胞存活率Tab.1 Survival rates of liver cancer HepG2 cells in viarous groups （n=3±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05， △△P＜0.01 compared with TBHP group.

Group Control TBHP Rutin Dose（μmol·L－1）400 0.25 0.50 1.00 A value 0.94±0.01 0.518±0.04 0.551±0.05 0.63±0.09 0.699±0.03 Survival rate（η/%）100.00±0.00 48.68±1.74*58.34±0.91△60.72±0.68△△66.84±2.12△△

2.3各組HepG2細胞中MDA和GSH水平及SOD活性對照組肝癌HepG2 細胞MDA 水平較低， GSH 水平和SOD 活性較高；與對照組比較，TBHP 組 肝 癌HepG2 細 胞MDA 水 平 升 高（P＜0.01）， GSH 水 平 和SOD 活 性 明 顯 降 低（P＜0.01）； 與TBHP 組 比 較， 不 同 濃 度 蘆 丁 組 肝 癌HepG2 細胞中MDA 水平逐漸降低（P＜0.01），GSH 水平和SOD 活性均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組HepG2 細胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性Tab.2 Levels of MDA and GSH and activity of SOD in HepG2 in various groups （n=3，±s）

表2 各組HepG2 細胞中MDA 和GSH 水平及SOD 活性Tab.2 Levels of MDA and GSH and activity of SOD in HepG2 in various groups （n=3，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with TBHP group.

Group Control TBHP Rutin 1.00 Dose[cB/(μmol·L－1)]400 0.25 0.50 MDA[cB/(μmol·L－1)]8.95±0.07 13.57±0.00*11.27±0.02△△10.02±0.03△△8.89±0.05△△SOD[λB/(U·mL－1)]49.31±0.57 10.49±0.07*16.44±0.79△24.37±0.43△△34.85±1.50△△GSH[mB/(μmol·g－1)]14.67±0.30 4.66±0.24*7.32±0.03△9.12±0.32△△13.65±0.80△△

2.4各組肝癌HepG2細胞中ROS水平對照組肝癌HepG2 細胞生成的綠色熒光微弱，幾乎看不見細胞被染色； 與對照組比較， TBHP 組肝癌HepG2 細胞生成的綠色熒光強度明顯增加，說明HepG2 細胞中ROS 水平升高，被染色的細胞數增加；與TBHP 組比較， 0.25、0.50和1.00 μmol·L－1蘆丁組肝癌HepG2 細胞熒光強度呈減弱的趨勢，說明HepG2 細胞中ROS 水平降低，被染色的細胞數逐漸減少。見圖2 （插頁一）。

2.5各組肝癌HepG2細胞中PI3K/Akt信號通路蛋白的表達水平

與對照組比較，TBHP 組肝癌HepG2 細胞中PI3K 和p-PI3K 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）， Akt 和p-Akt 蛋 白 表 達 水 平 均 明 顯 降 低（P＜0.05）；而與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組肝癌HepG2 細胞中PI3K 和p-PI3K 蛋白表達水平升高（P＜0.05），Akt 和p-Akt 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖3 和圖4。

圖3 各組肝癌HepG2 細胞中PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of PI3K, p-PI3K,Akt，and p-Akt proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

2.6各組HepG2細胞中NF-κB信號通路蛋白的表達水平與對照組比較，TBHP 組肝癌HepG2 細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與TBHP 組比較，各濃度蘆丁組HepG2 細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平降低（P＜0.05），1.00 μmol·L－1蘆丁組HepG2細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平達到最低。見圖5 和圖6。

3 討 論

氧化應激是最常見的應激損傷， 是細胞中ROS 水平超過細胞抗氧化能力的一種狀態，是肝損傷發生機制中的重要損傷機制和環節［6-7］。TBHP 具有較穩定、不宜分解的優勢，可以代謝為自由基中間體， 從而進一步引起脂質過氧化、GSH 耗竭和DNA 損傷，破壞抗氧化防御體系，使細胞氧化損傷甚至凋亡［8］。 TBHP 會引起DNA、蛋白質和脂質等生物分子的改變，尤其是調節與細胞凋亡和肝星狀細胞活化有關的信號傳導途徑，從而引起肝臟損傷［9］。蘆丁是一種從植物中提取的天然黃酮類化合物，是天然的抗氧化劑，具有多方面的生物活性和藥理作用，包括抗氧化、抗自由基、抗炎、抗病毒、清熱解毒、降血糖、降血脂、舒張血管、止血、拮抗血小板活化因子、神經保護、保肝以及抗腫瘤等作用［10-13］。 本研究結果表明：TBHP 使肝細胞存活率明顯降低，細胞中生成大量的ROS，細胞中脂質過氧化水平升高，抗氧化體系水平明顯降低。而蘆丁預處理可以增加細胞存活率，減少細胞中ROS 自由基和脂質過氧化反應產物的生成，明顯提高細胞的抗氧化能力，提示蘆丁對肝細胞損傷具有一定的防御和保護作用。本研究結果與儲金秀等［13］的研究結果一致。

圖4 各組肝癌HepG2 細胞中PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of PI3K, p-PI3K, Akt, and p-Akt proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

圖5 各組肝癌HepG2 細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of NF-κB, p-NFκB, and p53 proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

圖6 各組肝癌HepG2 細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of NF- κB, p-NF- κ B and p53 proteins in liver cancer HepG2 cells in various groups

PI3K/Akt 信號通路在癌細胞生長、存活、代謝、自噬和凋亡調控中起多方面重要作用，其對于細胞增殖和凋亡必不可少，在腫瘤疾病的發生發展中也起重要作用［14-18］。PI3K 被激活后，誘導下游蛋白Akt 的2 個位點磷酸化，激活的Akt 再磷酸化下游底物， 引發級聯反應［19］。 本研究結果顯示：TBHP 損傷引起PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達水平明顯降低，而蘆丁預處理能使PI3K 、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達水平升高，且有隨藥物濃度的增加而逐漸升高的趨勢，說明蘆丁對肝細胞損傷的保護作用可能與PI3K/Akt 信號通路有關聯。

NF-κB 是一種多效性的核轉錄因子，可調控多種基因的表達，這些基因也可促進各種腫瘤細胞的生 長、 存 活 和 轉 化［20-22］。 既 往 研 究［23］表 明：PI3K/Akt 信號通路中其下游蛋白Akt 可以激活B細胞的核因子κ 輕鏈增強子NF-κB；且體外研究［24］表明： 組成性活性Akt 可以激活鼠源雙微體（murine double minute gene 2， MDM2），MDM2是一種降解p53 減少細胞凋亡的E3 泛素蛋白連接酶，而其激活和核易位可以降低p53 水平， 從而降低p53 轉錄活性。 本研究結果表明： TBHP 組肝癌HepG2 細胞中NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平明顯升高，蘆丁預處理可使NF-κB、p-NF-κB 和p53 蛋白表達水平有所降低， 說明蘆丁能下調NF-κB 的活化及p53 蛋白的表達，從而抑制肝細胞凋亡。上述結果表明：蘆丁對PI3K/Akt 和NF-κB兩條信號通路的關鍵蛋白表達均有一定的調控作用，提示蘆丁對TBHP 引起的HepG2 細胞氧化損傷的保護作用可能與PI3K/Akt 和NF-κB 兩條信號通路有關聯。

綜上所述，蘆丁能夠抑制TBHP 引起的肝細胞的氧化損傷和細胞凋亡， 其機制可能與調控PI3K/Akt 和NF-κB 這2 條信號通路有關。由于肝細胞損傷臨床極為常見，部分肝損傷甚至經久不愈。蘆丁具有較好的抗肝細胞氧化損傷作用，且價格低廉， 不良反應少， 故具有廣泛的臨床研究前景。