GLI1 真核表達載體的構建、鑒定及其對肺癌PC9 細胞增殖的影響

陳微微, 安佳佳, 武 艷, 代娟娟, 杜 靜

（濱州醫學院附屬醫院腫瘤研究實驗室，山東 濱州256600）

肺癌是全球目前發病率和死亡率居首位的惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年升高趨勢，嚴重影響人類健康。SHH 信號通路是調控胚胎發育和細胞增殖分化的經典信號通路，在肺癌、胃癌、大腸癌、 肝癌、 胰腺癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中Hedgehog 軸 的 關 鍵 組 分 表 達 上 調［1-6］。 SHH 信 號通路處于靜止時，PTCH 抑制SMO 蛋白活性，從而抑制下游通路，當處于激活狀態時，PTCH 與SHH 結合后，解除對SMO 的抑制，促進GLI1 蛋白入核激活下游靶基因轉錄。GLI1 作為SHH 信號通路末端的一種直接調控靶基因的轉錄激活因子，可直接調控靶基因的轉錄和表達。研究［7-8］表明：針對GLI1 靶點的抑制劑GANT61 可特異性阻斷人肺癌細胞和髓母瘤細胞中GLI1 表達，從而抑制腫瘤細胞增殖。有學者［9］采用RNA 干擾技術有效抑制GLI1 基因表達，該方法能明顯提高人非小細胞肺癌耐藥細胞對順鉑的敏感性。研究［3］顯示：過表達GLI1 能促進胃癌細胞的增殖和轉移，但過表達GLI1 對肺癌PC9 細胞增殖的影響國內外尚未見報道。本研究成功構建了GLI1 基因的真核表達載體，并將其轉染至肺癌PC9 細胞中，通過細胞增殖和細胞克隆形成實驗驗證GLI1 促進細胞增殖的作用，為深入研究GLI1 在肺癌發生發展中的分子機制奠定基礎，同時也為開發治療肺癌的新靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器肺癌PC9 細胞和

pcDNA 3.1 過表達載體為本實驗室保存。胎牛血清和RPMI1640 培養基購于美國BI 公司，質粒小提試劑盒與膠回收試劑盒購于北京天根生物公司，TRIzol 和PCR 所需引物購于上海生物工程有限公司合成，GLI1 抗體購于美國Abcam 公司，Tubulin抗體購于美國Bioworld 公司，HRP 標記的山羊抗兔抗體購于美國CST 公司， 限制性核酸內切酶Hind Ⅲ、Xba Ⅰ和T4 連接酶購于美國NEB 公司，2×Taq PCR Mix 和T- 載體試劑盒購于中國Transgen 公司，CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所。 PCR 儀購于美國ABI 公司（ 型號ABI9700），37℃恒溫CO2孵箱購于美國Thermo 公司， 凝膠成像儀（Bio-Rad ChemiDoc XRS+） 購于美國伯樂公司， 多功能酶標儀（BIO-TEK SynergyHIM） 購于美國Omega Bio-Tek 公司， 光學顯微鏡購于日本Olympus 公司， 溫控細菌搖床（型號MaxQ6000） 購于美國Fisher 公司。

1.2引物設計根據GenBank 中GLI1 的序列，采用Primer 5 設計出含有Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性核酸內切酶位點的GLI1 特異性引物（下劃線處為酶切位點）。 引物序列： GLI1 （克?。?上游引物5'-CCCAAGCTTCCATGTTCAACTCGATGACC-3'，GLI1（克隆）下游引物5'-TGCTCTAGACTTTAGGCACTAGAGTTGAG-G-3'；GLI1（鑒定）上游引物5'-CCCAATCACAAGTCAGGTTCCT-3'，GLI1 （鑒定） 下游引物5'-CCTATGTGAAGCCCTATTTGCC-3'； β -actin 上 游 引 物 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'， β -actin 下 游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.3 GLI1的擴增和鑒定以pOTB7-GLI1 質粒為模板。反應體系：2×Taq mix 25 μL，上下游引物各2 μL （10 mmol·L－1）， 無 菌 純 水 補 足 體 系 至50 μL； 反應條件： 94 ℃、 5 min， 95 ℃、 10 s，54 ℃、 30 s， 72 ℃、 15 s， 共35 個 循 環， 72 ℃、10 min。0.5% 瓊脂糖凝膠電泳后回收GLI1 目的條帶并行測序鑒定。

1.4真核表達載體pcDNA3.1-GLI1的構建將測序正確的GLI1 回收產物與T 載體混合均勻，25 ℃、10 min 轉化至大腸桿菌DH5α 中，涂至氨芐青霉素抗性的LB 固態培養板上，37 ℃倒置培養過夜，挑取單個菌落，擴大培養后提取質粒，并進行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定、PCR 及測序鑒定。將測序正確的T-GLI1 質粒和pcDNA3.1 載體雙酶切后分別切膠回收目的條帶，通過T4 DNA 連接酶連 接， 轉 化至大腸桿菌DH5α 中， 涂于LB 平板（含有氨芐青霉素），37 ℃倒置培養過夜，次日挑取單菌落，振蕩培養過夜，小量提取重組質粒，并行雙酶切鑒定。 將鑒定正確的重組質粒命名為pcDNA3.1-GLI1， 采 用Nanodrop 測 定 濃 度， 置于－20 ℃備用。

1.5真核表達載體pcDNA3.1-GLI1的細胞轉染和GLI1 mRNA及蛋白表達水平檢測

將PC9 細胞接種至12 孔板中，待細胞貼壁生長至70%～80% 時，準備轉染。將1.5 μg 質粒溶于50 μL 培 養 基 作 為A 管， 將3 μL Lipofectamine 2000 溶于50 μL 培養基作為B 管，將A 和B 管 輕輕混合后，室溫放置20 min，加入準備好的細胞中，繼續培養48 h 后更換培養基，加入G418 篩選2 周后進行后續實驗。將PC9 細胞分為空質粒組（給予pcDNA3.1 質粒） 和重組質粒組（給予pcDNA3.1-GLI1 質 粒）。 采 用RT-PCR 法 檢 測 細 胞 中GLI1 mRNA 表 達 水 平。 將 細 胞 轉 染 48 h 后，5 000 r·min－1離心收集細胞，提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，采用2×Taq PCR SuperMix 進 行PCR 鑒 定。 以2 μg cDNA 為模板（100 μg·L－1），反應體系為2×Tag mix 10 μg ， 上 下 游 引 物 各1 μL （10 mmol·L－1），以無菌純水補足體系至20 μL。反應條件：94 ℃、5 min，95 ℃、10 s，54 ℃、20 s，72 ℃、15 s，共35 個循環；72 ℃、10 min。并進行3 次重復實驗，采用Image J 軟件分析灰度值，以GAPDH 作為內參，計算GLI1 mRNA 表達水平。

采用Western blotting 法檢測2 組細胞中GLI1蛋白表達水平。將細胞轉染48 h 后，5 000 r·min－1離心收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞30 min，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg 蛋白與適量蛋白上樣緩沖液混合均勻后， 100 ℃煮沸10 min， 進行10%SDS-PAGE 電泳分離，100 V/2 h 濕轉法將目的蛋白轉印至PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉封閉膜30 min后， 根據預染蛋白Marker 裁膜， 分別孵育抗體GLI1 （1∶1 000） 和α-Tubulin （1∶1 000） 抗體過夜。次日TBST 洗膜3 次后，孵育羊抗兔標記的二抗（1∶1 000） 室溫1 h，TBST 洗膜3 次后，加入ECL 底物顯色液，采用凝膠成像系統進行曝光拍照。采用Image J 軟件分析灰度值，以α-Tubulin為內參，計算GLI1 蛋白表達水平。

1.6 CCK-8法檢測2組細胞增殖活性將細胞懸液按1×104mL－1的 細 胞 密 度， 每 孔100 μL 接 種 于96 孔板，每組設6 個平行復孔。然后分別于培養24、 48、 72 和96 h 后， 在避光條件下加入10 μL CCK-8 反應液， 在37℃細胞培養箱避光反應2 h。2 h 后用酶標儀在450 nm 處檢測的吸光度（A） 值，以僅加培養液的孔為對照孔調零。以A 值表示各組細胞的增殖活性。

1.7克隆形成實驗檢測2組細胞克隆形成數將細胞以500 個/孔的密度接種于6 孔板，每組設3 個重復，每3 d 更換新鮮培養基繼續培養10 d。將細胞采用4% 甲醛固定15 min 后，結晶紫染色10 min，采用自來水洗滌至本底干凈，采用凝膠成像儀進行拍照，采用Image J 軟件計算各組細胞克隆形成數。

1.8統計學分析采用Graphpad Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析。2 組細胞中GLI1 mRNA 表達水平、GLI1 蛋白表達水平、細胞增殖活性和細胞克隆形成數以x±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GLI1的擴增和重組質粒的構建及鑒定從Potb7-GLI1 質粒中克隆出GLI1 （3 300 bp） 基因片段， 見圖1 A。 隨后將GLI1 基因片段克隆至pcDNA3.1 （5 400 bp） 載體上，并進行Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定，見圖1 B。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，GLI1 條帶大小與預期一致，雙酶切鑒定結果提示GLI1 已成功插入至pcDNA3.1 載體上。

2.2 2組PC9細胞中GLI1 mRNA和蛋白表達水平將pcDNA3.1 和pcDNA3.1-GLI1 質粒分別轉染PC9 細胞后，采用RT-PCR 法檢測2 組PC9 細胞中GLI1 mRNA 表達水平， 與空載體組（1.016±0.085） 比 較， 重 組 質 粒 組PC9 細 胞 中GLI1 mRNA 表 達 水 平（47.138±7.087） 升 高（P＜0.01）；采用Western blotting 法檢測GLI1 蛋白表達水平可見：與空載體組（0.561±0.061） 比較，重組質粒組PC9 細胞中GLI1 蛋白表達水平（1.334±0.055） 也明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖1 GLI1 重組質粒的構建和鑒定電泳圖Fig.1 Electrophoregram of construction and identification of GLI1 recombinant plasmid

圖2 2 組PC9 細胞中GLI1 mRNA(A)和蛋白(B)表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of GLI1 mRNA(A) and protein(B) in PC9 cells in two groups

2.3 2組PC9細胞增殖活性和克隆形成數與空載體組比較，24 和48 h 時重組質粒組PC9 細胞增殖活性差異無統計學意義（P＞0.05），72 和96 h細胞增殖活性明顯升高（P＜0.01），見圖3 和圖4?？寺⌒纬蓪嶒灒ㄅ囵B10 d） 結果顯示：重組質粒組PC9 細胞克隆形成數較空載體組明顯增加（P＜0.01），見圖5 （插頁三）。

圖3 各時間點2 組PC9 細胞的增殖活性Fig.3 Proliferation activities of PC9 cells in two groups at different time points

圖4 2 組PC9 細胞增殖形態表現(×10)Fig.4 Morphology of proliferation of PC9 cells in two groups（×10）

3 討 論

SHH 信號通路的異常激活在肺癌的發生發展中有重要作用［10］。該信號通路主要由分泌型糖蛋白配體SHH、2 個跨膜受體PTCH 和SMO 及核轉錄因子GLI 構成。GLI 蛋白家族在信號通路中占據重要地位，包含3 個成員（GLI1、GLI2 和GLI3），其中GLI1 是調控Hedgehog 通路最關鍵的轉錄因子。 本 課 題 組 前 期 研 究［11］表 明： 在 肺 癌 組 織 中GLI1 基因較癌旁組織異常高表達，且表達水平與患者預后呈負相關關系。中藥半枝蓮通過抑制該通路中SMO 表達，阻滯下游細胞周期檢驗點CyclinA等表達并抑制肺癌細胞增殖。亞硒酸鈉通過下調轉錄因子GLI1 及其下游干細胞轉錄因子SOX2 抑制肺癌細胞增殖和轉移［12］。Hedgehog 通路的異常激活與晚期非小細胞肺癌對順鉑耐藥具有相關性［13］，且該通路關鍵信號轉導組分SMO 和GLI1 的異常表達是導致非小細胞肺癌對內皮細胞生長因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR） 抑制劑耐 藥 和 轉 移 發 生 的 重 要 機 制［14-15］。 ZHANG 等［16］研究表明：雷公藤內酯酮通過SHH-GLI1 信號通路抑 制 肺 癌 發 生。YAO 等［3］研 究 顯 示：GLI1 在 胃癌組織中明顯高表達，過表達GLI1 可以促進胃癌細胞增殖和轉移，并且誘導藥物耐藥。在卵巢癌中，過表達GLI1 可以促進腫瘤發生轉移［17］。在基底細胞癌中，降低PTCH 表達后抑制細胞檢驗點Cyclin B1， 促 進GLI1 表 達［18］。 在 胰 腺 癌 中，GLI1 調控多種致癌基因，促進腫瘤的發生［4］。在肝癌中，GLI1 可通過ERK 信號通路促進肝癌的發生、 侵 襲 和 轉 移［19］。 針 對GLI1 的 靶 向 抑 制 劑 有GANT61 和GANT58 等［20］， 研 究［21-22］顯 示：GANT61 以劑量依賴的方式降低癌細胞增殖能力。

本研究成功構建了GLI1 的真核表達載體，建立了GLI1 穩定過表達的肺癌細胞系，同時證明了有GLI1 促進肺癌PC9 細胞增殖的能力。