黃芪多糖對(duì)人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP 細(xì)胞耐藥性的影響及其機(jī)制

柳 葉, 陳龍?jiān)?/p>

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床微生物學(xué)教研室,湖北 武漢 430065；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,湖北 武漢 430065）

肺癌在惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中占第一位［1］。順鉑（cisplatin， DDP） 作為肺癌的一線治療藥物，在臨床實(shí)際中長期應(yīng)用可引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，使其化療效果極不理想，因此尋找肺癌細(xì)胞DDP 逆轉(zhuǎn)劑非常有必要［2］。中藥治療腫瘤具有多靶點(diǎn)、多途徑和不良反應(yīng)少的優(yōu)勢(shì)，近年來研究其在抗腫瘤中的作用及其機(jī)制已經(jīng)成為抗腫瘤藥物 研 究 的 熱 點(diǎn)。 黃 芪 多 糖 （astragalus polysacharin， APS） 是黃芪的主要活性成分之一，具有抗病毒、改善腸道菌群和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等作用［3］。研究［4-6］顯示：APS 可抑制乳腺癌、肺癌和肝癌等多種腫瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于APS 對(duì)肺癌DDP 耐藥的研究較少， 既往研究［7-9］ 表 明：APS 能 降 低 結(jié) 直 腸 癌HT-29/DDP 細(xì)胞、卵巢癌SKOV3 和食管癌EC109/DDP 細(xì)胞的DDP 耐藥性。但APS 對(duì)肺癌耐藥性的作用及其具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究APS 對(duì)人肺癌DDP耐藥株A549/DDP 細(xì)胞耐藥性的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑和儀器人肺癌DDP 耐藥株A549/DDP 細(xì)胞購自武漢普諾賽公司。 APS 購自上海源葉生物公司， DDP 購自美國Sigma 公司，Transwell 小室購自美國Corning 公司，RIPA 裂解液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8 檢測(cè)試劑盒和JC-1 檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物，凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海翊圣生物， 兔抗B 細(xì)胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 related X protein， Bax ）、 P 糖 蛋 白（ P-glycoprotein， P-gp）、 磷 脂 酰 肌 醇3 激 酶（phasphatidy inositol-3 kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， AKT） 和β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔抗磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（phosphated phasphatidy inositol-3 kinase， p-PI3K） 和 磷 酸 化 蛋 白 激 酶 B（phosphated protein kinase B， p-AKT） 購自美國Abcam 公司。離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，超低溫冰箱購自青島海爾股份有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自日本Sanyo 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌DDP 耐藥株A549/DDP 細(xì)胞置于含10%FBS、1% 青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中生長，并置于37℃、5%CO2相對(duì)飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為維持細(xì)胞耐藥 性 于 培 養(yǎng) 體 系 中 加 入 DDP（1 mg · L－1），實(shí)驗(yàn)前2 周撤藥。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的A549/DDP 細(xì)胞，采用含10% 胎牛血清、1% 青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105mL－1，接入96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、APS 組、DDP 組和APS+DDP 組。其中APS 組分別加入不同濃度（25、50、100、200和400 mg·L－1） APS；DDP 組分別加入不同濃度（2、 4、 8 、 16 和32 mg·L－1） DDP； APS+DDP組分別加入不同濃度（2、4、8、16 和32 mg·L－1）DDP 及100 mg·L－1APS；每組設(shè)空白對(duì)照孔，每孔重復(fù)3 次。加藥后37℃培養(yǎng)24 h，加藥培養(yǎng)結(jié)束后加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育4 h，于酶標(biāo)儀450 mm 處檢測(cè)各孔吸光度（A） 值，計(jì)算細(xì)胞增 殖 抑 制 率。 細(xì) 胞 增 殖 抑 制 率=1 － ［ 實(shí) 驗(yàn)組A 值－空白對(duì)照組A 值］ /［對(duì)照組A 值－空白對(duì)照組A 值］ ×100%；計(jì)算DDP 時(shí)A549/DDP 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），APS 逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)=IC50（A549/DDP 耐藥細(xì)胞+DDP） /IC50（A549/DDP 耐藥細(xì)胞+DDP+APS），即APS 逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為使用APS 前DDP 對(duì)細(xì)胞IC50的值與使用APS后DDP 對(duì)細(xì)胞IC50值的比值， 該比值越大說明APS 逆轉(zhuǎn)耐藥作用越好。

1.4 Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、APS 組、DDP 組和APS+DDP 組。選用100 mg·L－1APS 和選用11.46 mg·L－1DDP 作為實(shí)驗(yàn)藥物濃度。藥物處理細(xì)胞24 h 后收集各組細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105mL－1。在24 孔板中加入800 μL 10% 胎牛血清培養(yǎng)基，并置入Transwell 小室， 在Transwell 上室分別接種200 μL 各組細(xì)胞懸液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，采用PBS 清洗1 次，采用70% 冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h。采用0.5% 結(jié)晶紫染液染色，室溫中放置20 min，PBS 清洗1 次，采用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移細(xì)胞擦試干凈，顯微鏡下拍照觀察遷移細(xì)胞數(shù)，以遷移細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率藥物處理A549/DDP 細(xì)胞24 h 后收集對(duì)照組、 APS 組、DDP 組和APS+DDP 組細(xì)胞，采用預(yù)冷的PBS 將細(xì)胞清洗2 次，1 500 r·min－1離心去上清，隨后采用AnnexinⅤ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒處理細(xì)胞：加入500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞；取5 μL AnnexinⅤ-FITC 與5 μL PI 混勻；室溫下避光反應(yīng)5 ～15 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率= （早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)） /細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位藥物處理A549/DDP 細(xì)胞24 h 后收集對(duì)照組、 APS組、 DDP 組和APS+DDP 組細(xì)胞， 采用預(yù)冷的PBS 將 細(xì) 胞 清 洗2 次，1 500 r·min－1離 心 去 上 清。隨后加入1 mL JC-1 染液混合， 在培養(yǎng)箱孵育20 min 后吸除上清，采用1×JC-1 染色緩沖液洗滌2 次后于流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。線粒體膜電位以JC-1 單體陽性細(xì)胞率（右下象限細(xì)胞百分率）表示。

1.7 Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、P-gp、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平藥物處理A549/DDP 細(xì)胞24 h 后收集對(duì)照組、APS 組、DDP 組和APS+DDP 組細(xì)胞，采用預(yù) 冷 的1×PBS 洗 滌 細(xì) 胞3 次； 1 500 r·min－1離心5 min 棄上清；加入蛋白裂解緩沖液，冰上裂解30 min；每隔10 min 將裂解液渦旋振蕩1 次；1 3000 r·min－1、4 ℃離心20 min，采用BCA 法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。上樣后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待目的蛋白充分分離后停止電泳，取出凝膠用蒸餾水適當(dāng)漂洗后轉(zhuǎn)印于PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將膜泡于含50 g·L－1脫脂奶粉的TBST 中封閉1 h，隨后將PVDF 膜浸泡于用封閉液稀釋的一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜，再在室溫下用二抗孵育2 h，加入ECL 化學(xué)發(fā)光顯影后掃描膠片，采用Image J 6.0 軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參β-actin 條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 各組A549/DDP 細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞線粒體膜電位、 細(xì)胞凋亡率、 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、 P-gp、 p-PI3K、 PI3K、 p-AKT 和AKT 蛋白表達(dá)水平均呈正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率隨著APS濃度的增加，APS 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。100 mg·L－1APS 對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，其細(xì)胞抑制率小于10%。為避免細(xì)胞增殖抑制作用由APS 引起，本實(shí)驗(yàn)選用無毒劑量100 mg·L－1作為后續(xù)聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中的藥物濃度。見圖1。

DDP 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞增殖有一定的抑制作用， 其IC50值 為22.6 mg·L－1。 無 毒 劑 量APS（100 mg·L－1） 聯(lián)合DDP 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的抑制同樣呈現(xiàn)劑量依賴性，其IC50值為11.46 mg·L－1。無毒劑量APS （100 mg·L－1） 的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為1.97 倍。見圖2。

2.2各組A549/DDP細(xì)胞遷移能力與對(duì)照組比較， APS 組A549/DDP 細(xì)胞遷移數(shù)無明顯變化。與APS 組比較，DDP 組A549/DDP 細(xì)胞遷移數(shù)降低。與DDP 組比較，DDP+APS 組A549/DDP 細(xì)胞相對(duì)遷移數(shù)降低。見圖3 （插頁四）。

2.3各組A549/DDP細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較，APS 組A549/DDP 細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）； 與APS 組比較， DDP 組A549/DDP細(xì) 胞 凋 亡 率 升 高（P＜0.05）； 與DDP 組 比 較，APS+DDP 組A549/DDP 細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4 和圖5。

圖1 CCK-8 法檢測(cè)不同濃度APS 處理后各組A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of A549/DDP cells in various groups after treated with different concentrations of APS detected by CCK-8 method

圖2 CCK 8 法檢測(cè)不同濃度DDP 處理后各組A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率Fig.2 Inhibitory rates of proliferation of A549/DDP cells in various groups after treated with different concentrations of DDP detected by CCK-8 method

2.4各組A549/DDP細(xì)胞線粒體膜電位與對(duì)照組比較，APS 組A549/DDP 細(xì)胞線粒體膜電位比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與APS 組比較，DDP 組A549/DDP 細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低（P＜0.05）；與DDP 組比較，APS+DDP 組A549/DDP 細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低（P＜0.05）。見 圖6 和圖7。

2.5各組A549/DDP細(xì)胞中BAX、Bcl-2、P-gp、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示： 與對(duì)照組比較，APS 組A549/DDP 細(xì) 胞 中Bcl-2、 P-gp、 PI3K、AKT、 p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 與APS 組比較， DDP 組A549/DDP細(xì) 胞 中Bcl-2 、 P-gp 、 PI3K 、 AKT 、 p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）， Bax蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。 與DDP 組比較，DDP+APS 組A549/DDP 細(xì) 胞 中Bcl-2、 P-gp、PI3K、AKT、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）， Bax 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖8 和圖9。

圖4 各組A549/DDP 細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of A549/DDP cells in various groups

圖5 各組A549/DDP 細(xì)胞凋亡率直條圖Fig.5 Histogram of apoptotic rates of A549/DDP cells in various groups

3 討 論

肺癌是呼吸系統(tǒng)較為常見的腫瘤，有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人們的健康。肺癌一般多見于中年以后的男性，近幾年隨著現(xiàn)代生活的發(fā)展，肺癌的發(fā)病率出現(xiàn)了上升和年輕化的趨勢(shì)，這一趨勢(shì)與不良生活習(xí)慣和環(huán)境污染有較大關(guān)系［10-11］。DDP 是世界上目前廣泛使用的化療藥物之一，在肺癌的治療過程中表現(xiàn)出較好的治療效果，但長期應(yīng)用可引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而導(dǎo)致治療效果不佳，因此為了提高患者的臨床治療效果， 尋找抵抗DDP 耐藥性的新藥十分必要［12-13］。APS 是黃芪中一種活性成分，具有抗腫瘤作用，另還具有成本低和不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。近年來研究［7-9］表明：APS 在對(duì)腫瘤耐藥性方面也有一定作用。 本研究結(jié)果也表明： 無毒劑量APS（100 mg·L-1） 聯(lián) 合DDP 對(duì)A549/ DDP 細(xì) 胞 的IC50值 為11.46 mg·L－1， 相 對(duì) 于DDP 單 藥 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的IC50值（22.6 mg·L－1），其逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為1.8 倍，說明無毒劑量APS （100 mg·L－1） 能夠逆轉(zhuǎn)A549/DDP 細(xì)胞的DDP 耐藥性。細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果亦表明：無毒的APS 與DDP 藥物聯(lián)用提高了DDP 藥物對(duì)A549/DDP 細(xì)胞遷移的抑制作用，說明APS 能在一定程度上恢復(fù)耐藥細(xì)胞A549/DDP 對(duì)DDP 的 敏 感 性。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A549/DDP 細(xì)胞線粒體膜電位Fig.6 Mitochondrial membrane potentials of A549/DDP cells in various groups detected by flow cytometry

A：Control group；B：APS group；C：DDP group；D：APS+DDP group.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs APS group；#P＜0.05 vs DDP group.

圖8 各組A549/DDP 細(xì)胞中Bax、Bcl-2、P-gp、PI3K、AKT、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of Bax,Bcl-2,P -gp, PI3K, AKT, p -PI3K, and p -AKT proteins in A549/DDP cells in various groups

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種由基因控制的自發(fā)的程序化死亡過程。細(xì)胞凋亡是主動(dòng)過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控等。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控，許多抗癌藥物都可以通過激活腫瘤細(xì)胞凋亡通路而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的［14］。 近年來研究［15-16］ 表明：腫瘤細(xì)胞的耐藥性與腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制障礙關(guān)系密切，腫瘤細(xì)胞能通過凋亡逃逸，而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。 本研究檢測(cè)各組A549/DDP 細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)： 無毒濃度的APS聯(lián)合DDP 作用于A549/DDP 細(xì)胞相對(duì)于DDP 單藥能明顯促進(jìn)DDP 對(duì)A549/DDP 細(xì)胞的凋亡作用，表明APS 聯(lián)合DDP 能重新激活A(yù)549/DDP 細(xì)胞凋亡通路。線粒體損傷造成線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的一個(gè)特征性的標(biāo)志［17］。Bcl-2 基因家族中的促凋亡和抗凋亡分子之間的平衡性對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的穩(wěn)定性有非常重要的作用， 其中Bcl-2 和Bax 對(duì)凋亡發(fā)生有著重要的“ 分子開關(guān)” 作用。Bax 位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激，其由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，從而引發(fā)線粒體跨膜電位的丟失通過，開放分子通道進(jìn)而使凋亡因子釋放增多。Bcl-2 是線粒體上的一種跨膜蛋白，通過與Bax 結(jié)合形成二聚體，可穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制促凋亡因子釋放從而起抗凋亡作用［18］。本研究結(jié)果顯示：無毒濃度的APS 聯(lián)合DDP 用藥能明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位和Bcl-2 的表達(dá)并提高Bax表達(dá)，表明APS 逆轉(zhuǎn)A549/DDP 耐藥性可能與線粒體膜電位下降引起的凋亡有關(guān)聯(lián)。

A：Control group；B：APS group；C：DDP group；D：APS+DDP group.*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs APS group；#P＜0.05 vs DDP group.

PI3K/AKT 信號(hào)通路由PI3K 和AKT 等分子組成，與細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡有關(guān)聯(lián)［19］。PI3K/AKT 通路中PI3K 一般指Ⅰ類PI3K （PI3KC Ⅰ），其是由1 個(gè)催化亞基和調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體，能夠被蛋白酪氨酸激酶受體、RAS 蛋白等激活。活化后的PI3K 可產(chǎn)生脂質(zhì)類產(chǎn)物磷脂酰肌醇- 3， 4， 5，三磷酸（phosphatidylinositol, 3, 4, 5 -trisphosphate,PIP3)，PIP3 作 為 第 二 信 使 與AKT 蛋白的PH 結(jié)構(gòu)域結(jié)合誘導(dǎo)其磷酸化從而活化AKT。P-gp 是一種高表達(dá)于耐藥細(xì)胞膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其能夠?qū)⑦M(jìn)入腫瘤細(xì)胞中的化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度，進(jìn)而增加腫瘤 細(xì) 胞 耐 藥 性［20］。 已 經(jīng) 有 相 關(guān) 研 究［21］表 明：PI3K/AKT 信號(hào)通路與腫瘤多藥耐藥性的發(fā)生發(fā)展過程有密切關(guān)系，抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路的異常激活可以降低腫瘤多藥耐藥性標(biāo)志物P-gp 的表達(dá)從而介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥性［22-23］。本研究結(jié)果顯示：與DDP 組比較，DDP+APS 組A549/DDP 細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT 和P-gp 蛋白表達(dá)水平明顯降低， 說明APS 可能通過抑制腫瘤細(xì)胞中PI3K/AKT 信號(hào)通路而逆轉(zhuǎn)P-gp 介導(dǎo)的DDP 耐藥性。

綜上所述， APS 可以降低A549/DDP 細(xì)胞耐藥性，其機(jī)制可能與其阻斷PI3K/AKT 信號(hào)通路和誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑有關(guān)聯(lián)。