梔子苷對實驗性帕金森病大鼠睡眠障礙的調節作用及其機制

駱曉峰, 李 瑤, 胡 江, 張宸豪

（1.吉林醫藥學院基礎醫學院生理學教研室, 吉林 吉林132013；2.吉林醫藥學院檢驗學院病原技術教研室，吉林 吉林132013；3.吉林醫藥學院附屬醫院口腔教研室,吉林 吉林132013）

帕金森病（Parkinson’s disease， PD） 是一種常見于中老年人的神經系統退行性疾病，以黑質多巴胺能神經元進行性缺失并伴有Lewy 小體為主要病理特征［1-2］。隨病情發展除運動功能障礙外，患者幾乎不可避免地出現睡眠障礙、抑郁、焦慮和癡呆等一系列非運動癥狀［3-5］，其中以睡眠障礙發生率最高，嚴重影響患者的生活質量。因此深入了解PD 的發病機制，尋找有效的神經保護劑仍是目前治療PD 的主要策略［6-7］。梔子苷是中藥梔子干燥成熟果實提取的環烯醚萜苷化合物， 是梔子發揮藥效的主要成分。最新研究［8-10］表明：梔子苷可以提高原代培養海馬神經元的抗氧化效應、抵抗細胞凋亡、調節腦小膠質細胞活化、改善小鼠記憶能力障礙。但外源補充梔子苷是否能夠改善睡眠障礙尚未見報道。本實驗在構建PD 動物模型的基礎上，進一步研究梔子苷改善PD 患者睡眠障礙的可能機制，為PD 的臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器清潔級Wistar 大鼠，體質量170～200 g，雌雄各半，購自吉林大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK （吉）2016-0003 ； 6- 羥 基 多 巴 （ 6-hydroxydopa，6-OHDA） 和阿卟嗎啡均購自美國Sigma 公司，抗壞血酸購自上海時代生物技術有限公司，梔子苷購自長春德爾塔生物技術有限公司。腦立體定位儀購自深圳瑞沃德公司，腦電信號采集分析系統購自成都泰盟公司，高效液相色譜儀購自日本島津公司，振動切片機購自德國萊卡公司，CR22G 高速離心機購自日本日立公司。

1.2大鼠PD模型的制備和動物分組隨機選取70 只Wistar 大鼠，以10 %水合氯醛腹腔注射麻醉，腦立體定位儀上顱腦平位固定。剝離腦膜，暴露前囟，根據大鼠立體定位圖譜，確定前腦內側束坐標（前囟前4.0 mm， 正 中 線 右1.7 mm， 硬 膜 下8 mm），微量注射器注射4 μL 6-OHDA （濃度為4 g·L－1，溶劑為含0.02 %抗壞血酸的生理鹽水溶液）， 注 射 速 度 為0.5 μL·min－1， 并 留 針10 min，以1 mm·min－1的速度緩慢拔針。大鼠清醒后連續3 d 腹腔注射青霉素。造模4 周后，腹腔注射阿卟嗎啡（1.0 mg·kg－1） 誘發旋轉實驗，記錄30 min大鼠旋轉圈數，隔日1 次，共3 次，3 次誘導旋轉圈數均大于210 r·30 min－1的大鼠被視為PD 模型大鼠。本實驗造模成功率為55 %，模型構建成功的30 只大鼠分為模型組、低劑量梔子苷組和高劑量梔子苷組，每組10 只，取10 只未造模的正常大鼠設為正常對照組。低和高劑量梔子苷組大鼠每日通過灌胃給予梔子苷溶液（50 和100 mg·kg－1，以PBS 水溶液配制），共4 周，正常對照組和模型組大鼠相同時間給予等量生理鹽水灌胃。

1.3各組大鼠睡眠時間檢測將大鼠固定于腦立體定位儀上。將3 個腦電電極植入顱骨內，將2 個肌電電極分別插在大鼠左、右側頸部深肌層，術后腹腔注射青霉素，連續3 d，恢復1 周后開始記錄大 鼠 的 腦 電 和 肌 電［11-13］。 腦 電 圖（electroencephalogram， EEG） 和 肌 電 圖（electromyography， EMG） 信 號 經 過 放 大 濾 過（EEG： 0.3～100 Hz； EMG： 10～100 Hz）， 再以256 Hz 掃描速度進行自動記錄，各組均記錄72 h 時大鼠的EEG 和EMG，并自動以10 s 為一個時間段分析、鑒別，對各組大鼠的睡眠覺醒周期進行分析，記錄各組大鼠總睡眠時間、覺醒時間、快波睡眠時間和慢波睡眠時間。

1.4高效液相色譜法（HPLC）分析各組大鼠紋狀體中多巴胺水平將各組大鼠采用10 %水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦置于0 ℃～4 ℃的人工腦脊液中，在腦片中仔細分離出紋狀體組織樣品， 將1 mg 樣 品 加 入0.04 mol·L 高 氯 酸100 μL，超聲粉碎30 s，使細胞破碎， 在4 ℃離心機內以14 000 r·min－1的 速 度 離 心30 min， 留 取 上 清 液，每組紋狀體樣品準確吸取20 μL 進行HPLC，記錄出峰時間與峰面積，采用Breeze 2 軟件計算單位體積樣品中多巴胺水平。

1.5統計學分析數據采用SPSS 15.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠總睡眠時間、覺醒時間、慢波睡眠時間、快波睡眠時間和紋狀體中多巴胺水平以±s表示，各組數據進行正態分布及總體方差齊性檢測，對符合正態分布且總體方差齊的指標采用單因素方差分析，不符合正態分布且總體方差不齊的指標進行非參數Kruskal-WallisH檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠總睡眠時間與正常對照組比較，模型組大鼠總睡眠時間明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量梔子苷組大鼠總睡眠時間明顯延長（P＜0.05）； 與低劑量梔子苷組比較，高劑量梔子苷組大鼠總睡眠時間明顯延長（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠總睡眠時間Fig.1 Total sleep time of rats in various groups

2.2各組大鼠覺醒時間與正常對照組比較，模型組大鼠覺醒時間明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量梔子苷組大鼠覺醒時間明顯縮短（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量梔子苷組大鼠覺醒時間明顯縮短（P＜0.05）。見圖2。

2.3各組大鼠慢波睡眠時間與正常對照組比較，模型組大鼠慢波睡眠時間明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量梔子苷組大鼠慢波睡眠時間明顯延長（P＜0.05）；與低劑量梔子苷組比較，高劑量梔子苷組大鼠慢波睡眠時間明顯延長（P＜0.05）。見圖3。

圖2 各組大鼠覺醒時間Fig.2 Awaken time of rats in various groups

圖3 各組大鼠慢波睡眠時間Fig.3 Slow wave sleep time of rats in various groups

2.4各組大鼠快波睡眠時間與正常對照組比較， 模型組大鼠快波睡眠時間明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，低和高劑量梔子苷組大鼠快波睡眠時間明顯延長（P＜0.05）；與低劑量梔子苷組比較，高劑量梔子苷組大鼠快波睡眠時間延長明顯（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠快波睡眠時間Fig.4 Fast wave sleep time of rats in various groups

2.5各組大鼠紋狀體中多巴胺水平與正常對照組比較，模型組大鼠紋狀體多巴胺水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量梔子苷組大鼠紋狀體多巴胺水平明顯升高（P＜0.05）；與低劑量梔子苷組比較，高劑量梔子苷組大鼠紋狀體多巴胺水平升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠紋狀體中多巴胺水平Fig.5 Dopamine levels in striatum of rats in various groups

3 討 論

PD 是一種常見于中老年人群的的神經系統退行性疾病，具有典型的運動癥狀，如靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩和步態異常，但除特征性的運動癥狀外，PD 患者還會出現非運動癥狀，如睡眠障礙、記憶障礙、情感障礙和自主神經功能紊亂等，且非運動癥狀可能早于運動癥狀的出現，其中以睡眠障礙發生率最高。嚴重影響患者生活質量。PD 患者睡眠功能障礙的發病機制尚未完全明確，可能是多基因多因素協同發揮作用，其發病機制無論是氧化應激、線粒體功能障礙還是蛋白質錯誤折疊、聚集、炎癥及神經遞質的興奮毒性等，均可導致多巴胺能神經元異常凋亡［14-17］。在PD 與凋亡的研究中，除了傳統的死亡受體途徑和經典的線粒體途徑外，已有證據表明內質網應激介導的凋亡參與了PD 的發病過程。

目前PD 的治療主要以西藥 “替代療法為主”，雖然能夠改善臨床癥狀，但長期大量應用會出現運動及精神障礙等不良反應，無法緩解多巴胺能神經元進行性變性引發的病理損傷。而中藥治療具有療效持久和不良反應少等優點，已成為近年來防治PD 新藥的研究熱點［18］。單味中藥、中藥復方和 針灸等治療效果均得到臨床肯定。 尹帥領等［19］發現：肉蓯蓉多糖通過激活Wnt/β-catenin 信號通路對6-HODA 致PD 大鼠具有神經保護作用；霍綺雯等［20］發現定振丸對PD 大鼠神經遞質及黑質多巴胺能神經元氧化應激具有改善作用。中藥梔子具有清熱瀉火和涼血解毒等功效。 有研究［21-25］表明：梔子苷可以提高損傷神經細胞活力，減輕神經細胞凋亡，對PD 小鼠模型具有調節DA 代謝和神經保護作用，改善創傷所致小鼠記憶功能障礙。但對睡眠障礙影響未見相關報道。本實驗采用腦內立體注射6-OHDA 構建PD 動物模型，因其可選擇性損傷黑質-紋狀體兒茶酚氨神經末梢，最終導致多巴胺能神經元發生退行性病變，多巴胺合成釋放減少。本研究結果顯示：與正常對照大鼠比較，PD 大鼠表現出總睡眠時間減少、覺醒時間延長、慢波睡眠減少、快波睡眠抑制和睡眠效率降低等不同程度的睡眠障礙，紋狀體中多巴胺水平明顯降低；各劑量梔子苷組大鼠總睡眠時間、慢波睡眠時間較模型組明顯延長，而覺醒時間較模型組明顯縮短，說明一定濃度的梔子苷可有效緩解帕金森模型大鼠的睡眠障礙，增加睡眠總時間，減少覺醒時間；各劑量梔子苷組大鼠紋狀體中多巴胺水平明顯高于模型組，因此推測梔子苷具有改善PD 模型大鼠睡眠障礙的作用機制很可能是梔子苷通過抑制興奮性氨基酸類神經遞質的釋放，對中腦多巴胺能神經元產生了神經保護性作用，進而提高紋狀體中多巴胺水平，這一研究成果為神經退行疾病的治療提供了有益的思路，尤其是對PD 的治療。但PD 發病機制受多種因素影響［26-27］，所以下一步將從細胞分子水平探討梔子苷神經保護作用機制，并在后續實驗中加以證實。