小豆蔻明對宮頸癌HeLa 細胞增殖的影響及其機制

崔銀峰, 柴夢鈺, 楊萬山, 潘 穎

（1.延邊大學附屬醫院口腔科，吉林 延吉 133000；2.延邊大學醫學院病理學教研室，吉林 延吉 133002；3.吉林大學中日聯誼醫院婦產科，吉林 長春 130033）

宮頸癌是全球第四大最常見的女性惡性腫瘤，每年約有53 萬新發病例，27 萬例死亡，是婦女癌癥死亡的主要原因之一［1］。目前，化療和放療是人類宮頸癌常見的治療干預手段，可作為初級治療、輔助治療或新輔助治療。然而宮頸癌晚期患者的預后仍然很差，采用常規治療后患者5 年總生存率約為40%［2］。因此，迫切需要開發更有效的、不良反應少的新型宮頸癌治療藥物。 小豆蔻明（cardamonin， CAR） 是從高良姜中分離出來的查爾酮。既往研究［3-7］表明：CAR 在結腸癌、乳腺癌和膠質母細胞瘤組織中具有明顯的抗腫瘤活性；此外CAR 還能抑制具有化療耐藥特性的胃癌細胞生長。目前有關CAR 對宮頸癌細胞增殖的影響及其相關機制尚未見報道。 本文作者觀察不同濃度CAR 對宮頸癌HeLa 細胞增殖的影響，并探討其可能的作用機制，為CAR 的臨床應用和宮頸癌的新藥開發提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人宮頸癌HeLa 細胞（美國ATCC 細胞庫）。CAR （中國惠科植物開發有限公司），CCK-8 試劑盒和hoechst33258 凋亡檢測試劑盒（中國碧云天生物技術有限公司），B 細胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、磷酸化 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 （phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase， p-PI3K）、 磷 酸 化蛋 白 激 酶 B （phosphorylated protein kinase B ，p-AKT） 和β-actin 抗體購自美國CST 公司。全波長酶標儀、細胞成像多功能酶標儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司， 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司。

1.2 CCK-8法檢測各組宮頸癌HeLa細胞活性取對數生長期的宮頸癌HeLa 細胞，接種于96 孔板中（5×103個細胞/孔），貼壁后以不同濃度CAR 處理24～72 h 作為不同濃度CAR 組，對照組不加入任何試劑。加入CCK-8 溶液（每孔20 μL） 孵育1 h，采用酶標儀于450 nm 處檢測各孔吸光度（A） 值，計算各組宮頸癌HeLa 細胞活性。細胞活性= （藥物處理樣品孔A 值/對照樣品孔A 值） ×100%。

1.3菌落形成實驗檢測各組宮頸癌HeLa細胞克隆形成能力不 同 濃 度（10、 20 和40 μmol · L－1）CAR 處理24 h 后，將對數生長期宮頸癌HeLa 細胞以每孔100 個細胞的密度接種于6 孔板中培養10 d，對照組不給予CAR （0 μmol·L－1CAR 組），結晶紫染色后，計數細胞菌落數，以細胞菌落數代表宮頸癌HeLa 細胞的克隆形成能力。

1.4 Hoechst33258染色檢測各組宮頸癌HeLa細胞凋亡形態表現將對數生長期HeLa 細胞接種于6 孔板中，待細胞密度生長至70%， 給予CAR 處理24 h后，每孔加入1 mL Hoechst33258 （10 mg·L－1），室溫孵育10 min； 抗熒光淬滅封片劑封片， 采用Cytation 5 多功能檢測系統進行熒光拍照，觀察各組宮頸癌HeLa 細胞凋亡形態表現。

1.5 Western blotting法檢測各組宮頸癌HeLa細胞中Bcl-2、Bax、p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平收集并裂解經CAR 處理后的細胞，取30 μg 蛋白經10%SDS-PAGE 電泳、轉膜，5% 脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜，采用HRP標記的二抗雜交，1 h 后采用Gel Doc 凝膠成像儀成像，以β-actin 作為內參對照，計算目的蛋白表達水平。 目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.6統計學分析采用Prism 7.0 統計軟件進行統計學分析。各組宮頸癌HeLa 細胞活性、細胞克隆形成數和細胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平及Bcl-2/Bax 比值經正態性檢驗呈正態分布，以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組HeLa細胞活性采用不同濃度CAR 分別處理24、48 和72 h 后，采用CCK-8 法檢測HeLa 細胞活性。CAR 以濃度依賴性方式降低宮頸癌HeLa細胞活性，并且隨著時間的增加，CAR 濃度越高時，HeLa 細胞活性越低（24 h：F=69.75，P=0.011 8； 48 h：F=222.6，P=0.000 4； 72 h：F=145.4，P=0.002 2）。見圖1。

2.2不同濃度CAR作用后各組宮頸癌HeLa細胞克隆形成數分別以10、20 和40 μmol·L－1CAR 處理HeLa 細胞24 h， 采用菌落形成實驗檢測CAR 對HeLa 細 胞 增 殖 的 影 響。 與 對 照 組（0 μmol · L－1CAR 組） 比較，隨著CAR 藥物濃度的增加，不同濃度CAR 組HeLa 細胞菌落形成數逐漸減少（P＜0.01）。見圖2 （插頁四） 和圖3。

圖1 各組宮頸癌HeLa 細胞活性Fig.1 Cell viabilities of cervical cancer HeLa cells in various groups

圖3 各組宮頸癌HeLa 細胞克隆形成數Fig.3 Clone formation number of cervical cancer HeLa cells in various groups

2.3各組HeLa細胞凋亡形態表現Hoechst33258染色結果表明： 對照組細胞核呈藍色且染色均勻； CAR 作用24 h 后，隨著CAR 濃度的增加，細胞核數量逐漸減少，出現明顯聚集、皺縮或碎裂的凋亡形態，且出現高度濃縮或破碎的亮藍色熒光染色。見圖4 （插頁四）。

2.4各組HeLa細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平與對照組比較，不同濃度CAR 組HeLa 細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平降低，而促凋亡蛋白Bax 表達水平明顯升高， Bcl-2/Bax 比值降低（P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組宮頸癌HeLa 細胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達情況Fig.5 Expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cervical cancer HeLa cells in various groups

2.5各組HeLa細胞中PI3K和AKT表達水平與對照組比較，不同濃度CAR 組HeLa 細胞中p-PI3K和p-AKT 蛋白表達水平均升高（p-PI3K：F=68.75，P=0.011 8； p-AKT：F=20.80，P=0.034 9）。見圖6。

3 討 論

圖6 各組宮頸癌HeLa 細胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達情況Fig.6 Expressions of p-PI3K and p-AKT proteins in cervical cancer HeLa cells in various groups

宮頸癌是世界范圍內最常見的婦科惡性腫瘤之一，已成為一個突出的公共衛生問題。據統計，宮頸癌發病率在婦科惡性腫瘤中排名第二，死亡率在女性生殖道惡性腫瘤中排名第一，是威脅女性健康的重要惡性疾病［8］。每年有50 多萬名婦女被診斷患有宮頸癌，并導致全世界30 多萬人死亡。宮頸癌的治療取決于診斷時疾病程度和當地可獲得的治療資源，包括徹底的子宮切除、化療、放療或兩者結合。放療技術的進步，例如強度調節放療已成為患有局部晚期疾病患者的首選治療方法。然而對于患有轉移性或復發性宮頸癌的女性，其總體預后仍然較差［9］。

CAR 為廣泛存在于豆蔻香料及姜科藥用植物中的主要查爾酮［10］，具有抗炎、抗腫瘤、血管舒張和抗感染等特性［11］。研究［12-14］顯示：CAR 可抑制多種癌細胞的增殖和轉移。 本研究結果顯示：CAR 以濃度依賴和時間依賴的方式抑制HeLa 細胞活性，并能夠抑制HeLa 細胞的菌落形成能力，表明CAR 能夠抑制HeLa 細胞增殖。

細胞死亡是控制癌癥進展的有效策略，多種化療藥物均采用該作用機制治療癌癥［15］。凋亡是程序性細胞死亡的主要類型之一，是一種基因調控現象，細胞形態表現為細胞皺縮、細胞膜起泡、染色質 凝 聚、DNA 斷 裂 和 核 碎 裂 等［16-17］。LIAO 等［18］研究表明：在小鼠白血病細胞中，CAR 能夠誘導細胞周期阻滯、凋亡并調控凋亡相關基因表達。本文作者采用Hoechst33258 染色發現：經CAR 處理后宮頸癌HeLa 細胞核出現皺縮或破碎。Bcl-2 蛋白家族是內源性線粒體凋亡途徑的重要啟動因子，主要包括促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2［19］。Bcl-2 蛋白是Bcl-2 家族的關鍵成員，是細胞程序性死亡的調節因子， 可促進細胞在許多系統中存活［20］。此外，細胞中Bax 過度表達可導致Bcl-2 蛋白表達水平降低，且調控Bax 和Bcl-2 能夠抑制腫瘤細胞增殖［21］。本研究結果表明：CAR 能夠促進HeLa 細胞中Bax 蛋白表達并下調Bcl-2 蛋白表達。

作為癌癥中最常見的不穩定信號通路，PI3K/AKT 信號通路參與調控細胞周期、細胞存活和基因組不穩定的過程和特征，抑制PI3K/AKT 通路能夠誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞生長［22］。李 翔 等［23］研 究 表 明：AKT 抑制劑MK2206 能 夠 抑制舌鱗癌TCA-8113 細胞增殖并誘導凋亡。ZHOU 等［24］研究表明：CAR 能夠通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制非小細胞肺癌的增殖和轉移。這與本研究結果一致，即在HeLa 細胞中，CAR 能夠下調p-PI3K 和p-AKT 表達水平，表明CAR 能夠抑制HeLa 細胞中PI3K/AKT 信號通路，從而誘導細胞凋亡，發揮抑制細胞增殖的作用。

綜上所述，CAR 可能通過調控PI3K/AKT 信號通路誘導HeLa 細胞凋亡，從而抑制細胞增殖，發揮抑制宮頸癌進展的作用。CAR 能夠抑制HeLa細胞活性和克隆形成能力，并能夠靶向凋亡相關調控基因Bcl-2 和Bax 蛋白誘導HeLa 細胞發生凋亡，其機制可能與下調PI3K 和AKT 表達有關。本研究結果為CAR 抗腫瘤作用的進一步開發和合理利用奠定了理論基礎，但CAR 誘導凋亡的確切機制尚未明確，需從分子生物學水平繼續探討。