抑制B7-H4 表達對結直腸癌HT-29 細胞增殖、凋亡和遷移的影響及其機制

馬緒哲, 湛玉東,2, 王 丹, 歷 春, 蓋曉東

（1.北華大學醫學院病理教研室，吉林 吉林 132013；2.湖北省荊門市第一人民醫院病理科，湖北 荊門 448000；3.北華大學醫學院免疫教研室，吉林 吉林 132013）

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。目前雖然手術治療、放療和化療等常規治療模式使患者的生存率得到一定程度的提高，但仍不甚理想，尋找結直腸癌發病機制及新的治療方法一直備受關注。B7-H4 屬于B7 家族成員之一，是一種細胞質-核穿梭蛋白［1］。研究表明：B7-H4 在卵巢癌［2］、膽囊癌［3］、腎癌［4］、肝癌［5］、胃癌［6］、膀胱癌［7］和甲狀腺癌［8］組織中高表達，其表達與腫瘤的發生發展及預后有密切關系。本課題組前期研究［9］證實：B7-H4 的表達與結直腸癌的浸潤深度和淋巴結轉移呈正相關關系，血清中B7-H4 的表達與結直腸癌的浸潤深度、腫瘤大小及淋巴結轉移呈正相關關系［10］。因此本課題組推測B7-H4 與結直腸癌的發展和轉移有密切關聯。目前，有關B7-H4 與結直腸癌關系的研究不多，對其作用機制的研究更少見。本實驗通過轉染B7-H4 shRNA 抑制結直腸癌HT-29 細 胞 中B7-H4 的 表 達， 觀 察 抑 制B7-H4 對HT-29 細胞生物學特性的影響，并對其分子機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人結直腸癌HT-29細胞購自美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection， ATCC）。 DME/F-12 培 養 液（美國HyClone 公司），胎牛血清（美國Gemini 公司）， pSilencer4.1-B7-H4-shRNA 和pSilencer4.1-scrambled shRNA （上海生工生物工程公司），G418 （美國Sigma 公司）， LY294002 和雷帕霉素（上海碧云天生物技術公司），B7-H4 單克隆抗體、Bcl-2 單克隆抗體和Caspase-3 單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology 公 司）， X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑盒（美國Roche 公司），細胞周期試劑盒和細胞凋亡試劑盒（美國Millipore 公司），基質金屬蛋白酶2 （matrix metalloproteinase 2，MMP-2） ELISA Kit、基質金屬蛋白酶9 （matrix metalloproteinase 9，MMP-9） ELISA Kit 和CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術公司），Transwell 小室（美國Corning 公司）， RNAiso Plus 試劑盒和PrimeScript ?RT 試 劑 盒（日 本TaKaRa 公 司）。Western blotting 電泳設備（美國Bio-Rad 公司），全自動酶標儀（瑞士Tecan 公司），實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 檢測系統（美國Thermo 公司），流式細胞儀（美國Millipore 公司）。

1.2細胞培養和轉染將人結直腸癌HT-29 細胞接種于培養瓶中，加入含10% 胎牛血清和雙抗的DME/F-12 培養基，置于37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的培養箱中培養傳代。 取對數生長期的HT-29 細胞以每孔6×105個細胞的密度接種至6 孔板中， 當細胞達到70%～80% 融合時進行轉染。按照X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑盒說明書操作， 分 別 轉 染 pSilencer4.1-B7-H4-shRNA 和pSilencer4.1-scrambled shRNA 載 體 至HT-29 細 胞，轉染24 h 后加入G418 （600 mg·L－1） 進行壓力篩選，3 周后獲得穩定的單克隆細胞株。將細胞分為B7-H4 shRNA 組 和scramble shRNA 組。

1.3 RT-qPCR法檢測2組HT-29細胞中B7-H4 mRNA表達水平按照RNAiso Plus 試劑盒說明書提取RNA，按照PrimeScript?RT 試劑盒說明書進行逆轉錄， 將得到的cDNA 作為模板進行RT-qPCR 檢測，反應體系為10 μL，B7-H4 引物上游序列為5′-TAT TAG CAG CCG CTC TGT GC-3′，下 游 序 列 為5′-TCA GGA TTC CAT CCT CCC CA-3′； GAPDH 引物上游序列為5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′， 下 游 序 列 為5′-GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATATC-3′。反應條件： 95 ℃、 15 min， 95 ℃、 10 s， 60 ℃、10 s， 共40 個 循 環。 以GAPDH 為 內 參， 采 用2－△△Ct法 分 析 各 組HT-29 細 胞 中B7-H4 mRNA 表達水平。

1.4 Western blotting法檢測2組HT-29細胞中B7-H4、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平胰蛋白酶消化收集2 組細胞，PBS 充分洗滌細胞后，置于含RIPA 緩沖液的蛋白裂解液中冰上孵育30 min，4℃、 15 000 g 離心15 min 后收集上清液。 采用BCA 法測總蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg，10%SDS-PAGE 電泳1 h， 濕轉法將膠內蛋白轉到PVDF 膜上，采用5% BSA 室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入B7-H4、Bcl-2、Caspase-3 和β-actin 抗體（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜。 次日，TBST 洗滌PVDF 膜3 次，加入HRP 標記的二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次，ECL 發光并拍照，以β-actin 作為內參。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.5 CCK-8法檢測2組HT-29細胞增殖活性將對數生長期的2 組細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96 孔板，每組設3 個復孔。2 組細胞分別培養24、48、72 和96 h 后 每 孔 添 加10 μL CCK-8 溶液繼續培養2 h。采用酶標儀檢測2 組細胞在酶標儀450 nm 處的吸光度（A） 值，以A 值代表各組HT-29 細胞增殖活性。以時間為橫坐標、以A值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.6流式細胞術檢測2組HT-29細胞周期和細胞凋亡率細胞周期檢測：取對數生長期的2 組細胞（1×106mL－1） 于EP 管中，每組收集3 管細胞，加入預冷無水乙醇，4℃固定過夜。次日，棄固定液后按照Muse?細胞周期試劑盒說明書進行操作，濾網過濾細胞，采用流式細胞術檢測2 組不同細胞周期細胞百分率。細胞凋亡率檢測：取對數生長期的各組細胞（1×106mL－1） 于EP 管中，每組收集3 管細胞。按照ApopNexin?FITC 凋亡試劑盒說明書進行Annexin Ⅴ/PI 雙染色，采用流式細胞術檢測2 組細胞凋亡率。

1.7 Transwell法檢測2組HT-29細胞的遷移細胞數取對數生長期的2 組細胞，無血清培養基重懸2 組細胞，將重懸液以1×105mL－1（100 μL） 置于Transwell 小室（孔隙8 μm） 的上室， 下室加入600 μL 含有10% 胎牛血清的培養液。培養24 h 后，采用棉球擦去上室殘留的細胞， 多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌3 次，蘇木素染色5 min，蒸餾水清洗后自然風干，在倒置顯微鏡下觀察2 組遷移細胞數。

1.8 ELISA法檢測2組HT-29細胞上清液中MMP-2和MMP-9水平2 組 細 胞 培 養72 h ，2 000 g 離心10 min 后收集細胞培養上清液，然后按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測各組HT-29細胞上清液中MMP-2 和MMP-9 水平。

1.9 PI3K/Akt/mTOR信號通路調控后HT-29細胞中B7-H4 mRNA和蛋白表達水平的檢測取對數生長期的HT-29 細胞以每孔5×105個細胞的密度接種于6 孔板，培養過夜。采用PI3K/Akt 抑制劑LY294002 （10 μmol·L－1， LY294002 組） 和mTOR 抑制劑雷帕霉素（50 nmol·L－1，雷帕霉素組） 24 h 持續作用于HT-29 細胞；同時設未加抑制劑 的 對 照 組。 收 集 細 胞， 分 別 采 用“1.3” 和“1.4” 中的方法檢測各組HT-29 細胞中B7-H4 mRNA 和蛋白表達水平。

1.10統計學分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中B7-H4 mRNA 和蛋白表達水平、細胞增殖活性、不同細胞周期細胞百分率、 細胞凋亡率、 遷移細胞數及細胞中Bcl-2、Caspase-3、 MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平均符合正態分布且方差齊性，以-x±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組HT29細 胞 中B7-H4 mRNA和 蛋白表 達情況RT-qPCR 檢測結果顯示： 與scramble shRNA 組（1.000 ± 0.100） 比較，B7-H4 shRNA組HT29 細胞中B7-H4 mRNA 表達水平（0.480 ±0.120） 明顯降低（P＜0.01）。Western blotting 檢測結果顯示： 與scramble shRNA 組比較， B7-H4 shRNA 組HT29 細胞中B7-H4 蛋白表達量降低。見圖1。

圖1 Western blotting 法檢測2 組HT-29 細胞中B7-H4 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of B7 - H4 protein in HT - 29 cells in two groups detected by Western blotting method

2.2 2組HT-29細胞增殖活性采用B7-H4 沉默后，HT-29 細胞增殖活性明顯降低。 作用72 和96 h 時，B7-H4 shRNA 組HT-29 細 胞 增 殖 活 性 低于scramble shRNA 組（P＜0.05）。見圖2。

2.3 2組不同細胞周期HT-29細胞百分率與scramble shRNA 組 比 較， B7-H4 shRNA 組G0/G1期和S 期HT-29 細胞百分率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3 （插頁四） 和圖4。

圖2 CCK-8 法檢測2 組HT-29 細胞增殖活性Fig.2 Proliferation activities of HT-29 cells in two groups detected by CCK-8 method

圖4 2 組不同細胞周期HT-29 細胞百分率Fig.4 Percentages of HT-29 cells at different cell cycles in two groups

2.4 2組HT-29細胞 凋 亡 率B7-H4 shRNA 組 細胞 凋 亡 率 為（24.550 ± 2.810）%， scramble shRNA 組 細 胞 凋 亡 率 為（8.740 ± 1.620） % 。B7-H4 shRNA 組細胞凋亡率較scramble shRNA 組明顯升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 流式細胞術檢測2 組HT-29 細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of HT - 29 cells in two groups detected by flow cytometry

2.5 2組HT-29細胞中Bcl-2和Casapse-3蛋白表達量與scramble shRNA 組比較， B7-H4 shRNA組HT-29 細胞中Bcl-2 蛋白表達量降低，Casapse-3蛋白表達量升高。見圖6。

2.6 2組HT-29細胞遷移細胞數與scramble shRNA 組［（210.000±15.600） 個］ 比較， B7-H4 shRNA 組遷移細胞數［（74.000±8.200） 個］明顯降低（P＜0.01）。見圖7 （插頁四）。

2.7 2組HT-29細胞上清液中MMP-2和MMP-9水平與scramble shRNA組［（3.150±0.280） μg·L－1和 （2.120±0.300） μg·L－1］ 比 較 ， B7-H4 shRNA 組 HT-29 細 胞 上 清 液 中 MMP-2［ （2.000±0.340） μ g·L－1］ 和 MMP-9［（1.150±0.270） μ g·L－1］ 水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 Western blotting 法檢測2 組HT-29 細胞中Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of Bcl - 2 and Caspase-3 proteins in HT-29 cells in two groups detected by Western blotting method

2.8 PI3K/Akt/mTOR信號通路調控前后HT-29細胞中B7-H4 mRNA和蛋白表達水平與對照組（1.000 ± 0.110 和 1.000 ± 0.100） 比 較，LY294002 組（0.560 ± 0.140） 和 雷 帕 霉 素 組（0.510 ± 0.120） HT-29 細 胞 中B7-H4 mRNA 表達水平均降低（P＜0.05）。 Western blotting 法檢測結果顯示：與對照組比較， LY294002 組和雷帕霉素組HT-29 細胞中p-Akt、p-mTOR 和B7-H4 蛋白表達水平均降低。見圖8 和圖9。

圖8 Western blotting 法檢測加入LY294002 前后2 組HT-29 細胞中B7-H4、p-Akt 和p-mTOR 表達電泳圖Fig.8 Electrophregram of expressions of B7-H4, p-Akt，and p-mTOR proteins in HT-29 cells before and after LY294002 treatment in two groups detected by Western blotting method

圖9 Western blotting 法檢測加入雷帕霉素前后2 組HT-29細胞中B7-H4、p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達電泳圖Fig.9 Electrophregram of expressions of B7-H4, p-Akt，and p-mTOR proteins in HT -29 cells before and after rapamycin treatment in two groups detected by Western blotting method

3 討 論

B7-H4 是新近發現的B7 家族新成員，對T 淋巴細胞介導的免疫應答起重要的負性調節作用［11］。研 究［2-8，12］表 明： B7-H4 在 多 種 腫 瘤 組 織 中 高 表達，與腫瘤的發生發展和預后有密切關聯。此外，在多種腫瘤患者的血液樣本中也可檢測到可溶性B7-H4 （sB7-H4），提示sB7-H4 可為腫瘤的診斷及預后提供一個新靶點［13-15］。本課題組前期研究［9-10］顯示：結直腸癌患者的癌組織和血清中B7-H4 均高表達，且與結直腸癌的發展呈正相關關系。上述研究表明：B7-H4 可能通過某些潛在的機制促進結直腸癌的發生發展。因此，探討B7-H4 在結直腸癌細胞增殖、凋亡和遷移中的作用可為結直腸癌的基因治療提供依據。

本研究通過在結直腸癌HT-29 細胞中轉染B7-H4 shRNA 抑制B7-H4 表達，并采用RT-qPCR 和Western blotting 法驗證轉染效果證實：轉染B7-H4 shRNA 能夠有效抑制HT-29 細胞中B7-H4 的表達；CCK-8 實驗結果顯示：抑制B7-H4 的表達能夠明顯抑制HT-29 細胞的增殖能力；流式細胞術分析結果表明： 抑制B7-H4 的表達可有效提高HT-29細胞凋亡率，但對HT-29 細胞周期分布并無影響。

細胞凋亡與腫瘤的發生發展有密切關聯，誘導腫瘤細胞凋亡可抑制腫瘤進一步發展。細胞凋亡分子調控機制研究［16-17］顯示：細胞線粒體中的促凋亡和抗凋亡Bcl-2 家族蛋白之間的平衡改變，可誘導Caspase-8 和Caspase-3 的活化，從而導致細胞凋亡的發生。本研究結果顯示：在B7-H4 shRNA 轉染的HT-29 細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調，促凋亡蛋白Caspase-3 表達上調，提示B7-H4 沉默誘導的細胞凋亡機制主要是通過線粒體途徑實現。

腫瘤的遷移是個復雜過程，主要表現為腫瘤細胞骨架重排、腫瘤細胞和基底膜黏性增加，細胞外基質（extracellular matrix， EMC） 分泌金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）［18］。MMPs，尤其是MMP-2 和MMP-9，能夠降解多種ECM 大分子加快腫瘤細胞的侵襲［19］。 此外， MMP-2 和MMP-9 的高表達與腫瘤患者的不良預后有關聯［20-21］。 本 研 究 沉 默B7-H4 表 達 后 發 現： HT-29 細胞遷移能力、 MMP-2 和MMP-9 表達水平均降低，即B7-H4 表達受到抑制后，HT-29 細胞遷移能力降低可能與MMPs 分泌減少有關聯。

信號通路的異常激活與腫瘤的發生發展有密切關 聯［22］。 PI3K/Akt/mTOR 信 號 通 路 是 近 二 十 年來研究最為廣泛的信號通路之一，研究［23-25］顯示：PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活可促進結直腸癌的發生發展。本研究探討PI3K/Akt/mTOR 信號通路對HT-29 細胞中B7-H4 表達影響的結果顯示：抑制p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達后，B7-H4 mRNA和蛋白質的表達均明顯降低，提示B7-H4 可能通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路調節結直腸癌細胞的生物學行為。

本研究結果證實：靶向性shRNA 沉默B7-H4能夠有效抑制HT-29 細胞增殖、細胞凋亡和細胞遷移，其機制可能與調控PI3K/Akt/mTOR 信號通路有關聯。本研究為探討結直腸癌的致病機制和靶向治療提供了實驗依據。