IL-17A 對前列腺癌細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用及其機(jī)制

肖梓屾, 刁書騰, 張莉爽, 劉 杰,2, 楊麗娟, 馮新雨, 王振江, 劉艷波

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕病科，吉林 吉林132013；3.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013）

慢性炎癥與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)，有研究［1］證實(shí)：大約25% 的癌癥是由慢性炎癥惡性轉(zhuǎn)化形成。幾乎所有前列腺手術(shù)切除標(biāo)本都存在不同程度的炎癥［2-3］，前列腺炎癥可由感染、尿液反流、飲食因素和創(chuàng)傷等原因引起［4］。炎癥過程中伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子釋放。本課題組前期工作［5-7］證實(shí)： 在良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH） 和前列腺癌組織中均存在炎癥細(xì)胞浸潤，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤等。炎癥細(xì)胞激活可釋放大量的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)和自由基等，其中白細(xì)胞介素17 （interleukin-17， IL-17） 家族是非常重要的促炎細(xì)胞因子， 該家族成員包括IL-17A～F 這6 種配體以及IL-17RA～E 這5 種受體。IL-17A 可由Th17 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞和NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也可合成IL-17A［5-7］。 IL-17A 與 IL-17RA 、 IL-17RC 和IL-17RA/IL-17RC 受體復(fù)合物結(jié)合， 通過激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程誘導(dǎo)細(xì)胞因子合成，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病和惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮 重 要 作 用［8］。 本 課 題 組 前 期 工 作［5-7］表 明：IL-17 家族成員在前列腺癌、膀胱癌和直結(jié)腸癌組織中均有不同程度高表達(dá)，其中，IL-17A 在上述各種惡性實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)水平均升高，且隨著疾病惡性度增加，其表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，在前列腺癌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)水平明顯高于正常前列腺（normal prostate， NP） 及BPH 組織。 IL-17A重組蛋白與直結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖［9］，但I(xiàn)L-17A 是否具有促進(jìn)前列腺癌增殖及遷移作用，目前尚無相關(guān)研究報道。本實(shí)驗(yàn)觀察IL-17A、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3 （signal transducer and activator of transcription 3，Stat3） 和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 在前列腺癌組織中的表達(dá)差異及其與腫瘤惡性度的相關(guān)性，驗(yàn)證IL-17A 重組蛋白對前列腺癌細(xì)胞增殖及遷移的作用， 進(jìn)而探討IL-17A 對前列腺癌作用的相關(guān)機(jī)制，為將IL-17A作為前列腺癌診斷及治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象選取2017 年10 月—2019 年10 月北華大學(xué)附屬醫(yī)院、吉林省吉林市人民醫(yī)院和吉林省吉林市中心醫(yī)院等提供的前列腺組織標(biāo)本73 例。其中NP 標(biāo)本（手術(shù)切除的癌旁組織） 8 例，標(biāo)本來源患者平均年齡為（61.7±4.9） 歲；BPH 標(biāo)本30 例， 標(biāo) 本 來 源 患 者 平 均 年 齡 為 （60.7±5.0） 歲；前列腺癌標(biāo)本35 例，標(biāo)本來源患者平均年齡為（64.2±5.1） 歲。BPH 診斷標(biāo)準(zhǔn)：排尿困難、尿細(xì)無力、費(fèi)時費(fèi)力、尿頻和夜尿增多；肛門指診，兩側(cè)葉增大光滑、有彈性，B 超檢查：前列腺體積增大（前列腺體積=0.52×三經(jīng)線之乘積，按質(zhì)量＞20 g 計算，體積＞19.05 cm3為診斷標(biāo)準(zhǔn)）；尿流率測定，尿量＞150 mL ；殘余尿量，經(jīng)腹B 超檢查膀胱殘余尿?yàn)?0～60 mL。 納入標(biāo)準(zhǔn)： 符合BPH 診斷標(biāo)準(zhǔn)， 1 周以來未使用治療BPH 的藥物， 知情同意且自愿受試。 排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整，并發(fā)各種慢性感染，患者有嚴(yán)重的心功能不全和腎功能不全等。前列腺癌診斷的病理標(biāo)準(zhǔn)：以超聲引導(dǎo)下經(jīng)直腸前列腺系統(tǒng)穿刺活檢的病理結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：有完整的影像數(shù)據(jù)和詳細(xì)的臨床資料，經(jīng)過系統(tǒng)穿刺活檢病理證實(shí)為前列腺癌，且穿刺與影像檢查前后相隔不超過6 個月，患者1 周內(nèi)未進(jìn)行治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)過內(nèi)分泌治療和放射性治療等治療方案，并發(fā)嚴(yán)重的感染。前列腺癌病理分級采用Gleason 評分標(biāo)準(zhǔn)：其 中 高 分 化（Gleason 2～4 分） 5 例， 中 分 化（Gleason 5～7 分） 22 例， 低 分 化（Gleason 8～10 分） 8 例，所有標(biāo)本均采用雙盲法閱片，由2 名病理醫(yī)師獨(dú)立完成。患者手術(shù)前1 周內(nèi)均未進(jìn)行導(dǎo)尿和前列腺按摩等檢查，術(shù)前未接受任何治療。另收集前列腺癌患者血清標(biāo)本40 例， 平均年齡為（66.5±6.8） 歲；男性健康志愿者血清標(biāo)本40 例，平均年齡為（63.9±5.3） 歲。前列腺癌患者和健康對照者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均對該研究知情，自愿參與并簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞、主要試劑和儀器PC3 細(xì)胞由吉林大學(xué)前列腺疾病研究中心惠贈。 胎牛血清、 胰酶和DMEM 培養(yǎng)基購自北京中杉金橋有限公司，IL-17A 重組蛋白和山羊抗人IL-17RA 抗體（ab133416，1∶400） 購自美國Abcom 公司，兔抗人IL-17A 抗體（NBP1-42746， 1∶100）、 兔抗人p-stat3 多克隆抗體（NBP2-24463，1∶400）、兔抗人Stat3 單克隆抗體（NBP2-674321∶300） 和鼠抗人VEGF 單克隆抗體（NB100-648，1∶200） 均購自美國NOVUS Biologicals 公司， 人源性VEGF ELISA 試劑盒（DVE00）、 人源性IL-17A ELISA試劑盒（DY317） 和人源性IL-6 ELISA 試劑盒（D6050） 購自美國NOVUS Biologicals 公司，人源性基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP-9） ELISA 試劑盒購自奧地利維也納eBioscience 公 司，RIPA 裂 解 液、SDS-PAGE 蛋 白上樣緩沖液（6×） 和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自廣州碧云天公司，二甲基亞砜和麗春紅染色液購自北京索萊寶有限公司，丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、異丙醇、SDS、甘氨酸、氯化鈉和甲醇等均為美國Sigma 公司生產(chǎn)。Olympus 顯微鏡成像系統(tǒng)由日本Olympus 公司生產(chǎn)，Infinite 200 分光光度計由奧地利TECAN 公司生產(chǎn)，Centrifuge 5424 高速離心機(jī)由德國Eppendorf 公司生產(chǎn)， 恒溫孵育箱CNP-9160 由精鷹醫(yī)療器械公司提供，高壓滅菌鍋（ZEALWAY-GR60DR） 和低溫冷凍離心機(jī)由湘儀有限公司提供，凝膠成像儀、垂直電泳槽和濕式轉(zhuǎn)膜槽為美國Bio-Rad 公司生產(chǎn)。

1.3免疫組織化學(xué)染色和判定標(biāo)準(zhǔn)石蠟包埋的病理標(biāo)本經(jīng)100% 二甲苯脫蠟，依次放入不同濃度梯度酒精入水；自來水沖洗5 min，磷酸鹽緩沖液漂洗； 將標(biāo)本置于含0.01 mol·L－1檸檬酸緩沖液中，高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后磷酸鹽緩沖液充分漂洗3 次，加入1% H2O2溶液常溫孵育，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加不同稀釋度的一抗（IL-17A、 IL-17RA、 Stat3 和VEGF）， 4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液充分漂洗后；滴加二抗，常溫孵育，磷酸鹽緩沖液充分漂洗，DAB 溶液顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精輕度復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，干燥，中性樹膠封片。拍攝樣品照片時選取圖片上目標(biāo)區(qū)域（area of interesting， AOI）， 測 量 該 區(qū) 域 的 累 計 吸 光 度（IA） 值，選擇并測量有效統(tǒng)計區(qū)域的面積，計算IA 的平均值（IA /area）， 將拍好的照片采用Image-Pro Plus 9.1 軟件對染色陽性的部分進(jìn)行客觀定量分析，以每組所拍照片的平均值作為量化后的數(shù)值。

1.4 ELISA法檢測血清IL-17、IL-6、VEGF和MMP-9水平在已經(jīng)包被的反應(yīng)孔中加入稀釋后的血清標(biāo)本0.1 mL， 37℃孵育1 h；充分洗滌后各反應(yīng)孔中加入酶標(biāo)抗體0.1 mL，37℃繼續(xù)孵育1 h；充分洗滌后加入新鮮配置的四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5， 5'-Tetramethylbenzidine ， TMB） 底 物 溶 液0.1 mL， 37℃繼續(xù)孵育30 min；每個反應(yīng)孔中加入酸性溶液0.05 mL 終止反應(yīng)。以空白對照孔調(diào)零，450 nm 處檢測各反應(yīng)孔A 值， 并計算血清IL-17、IL-6、VEGF 和MMP-9 水平（根據(jù)已知濃度的抗體標(biāo)準(zhǔn)品， 經(jīng)過濃度稀釋， 檢測標(biāo)準(zhǔn)品的A 值， 將檢測的A 值代入線性關(guān)系計算公式，計算待測樣品水平）。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞遷移能力采用Marker 筆在6 孔板背面均勻劃線，在6 孔板中加入5×105個細(xì)胞，過夜后使細(xì)胞融合率為100%。采用槍頭垂直于孔板背后的劃線進(jìn)行劃痕。PBS 洗滌3 次，去除脫落細(xì)胞，對照組加入新鮮無血清培養(yǎng)基 培 養(yǎng)， 實(shí) 驗(yàn) 組 加 入 終 濃 度 為100 μ g·L－1的IL-17A 重組蛋白，于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察不同時間（0、 6、 12 和24 h） 細(xì)胞劃痕情況并拍照。在劃痕每側(cè)邊緣均選取30 個點(diǎn)后取其中線代表劃痕邊緣，測量不同時間點(diǎn)劃痕邊緣的最小距離，并用以下公式計算遷移距離，遷移距離＝0 h時劃痕邊緣的最小距離－n h 時劃痕邊緣的最小距離（n 代表不同時間點(diǎn)），進(jìn)而計算不同時間點(diǎn)遷移距離的大小。采用Image J 軟件計算劃痕線之間距離的平均值，比較各組劃痕愈合情況。以細(xì)胞遷移距離代表各組細(xì)胞遷移能力。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各組遷移細(xì)胞數(shù)制備PC3 細(xì) 胞 懸 液， 將4×105個 細(xì) 胞 接 種 于Transwell 小室的上室，向Transwell 小室的上室中加入無血清DMEM 培養(yǎng)基作為對照組，以含50 和100 μg·L－1IL-17A 重組蛋白的無血清DMEM 培養(yǎng)基為給藥組，給藥組和對照組Transwell 小室的下室中均加入含25% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)水平將前列腺癌細(xì)胞胰酶消化后，分別接種于4 個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，分別向4 個培養(yǎng)瓶中加入終濃度為0、20、50和100 μg·L－1的IL-17A 重組蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，收集前列腺癌細(xì)胞，加入150 μL 超聲 裂 解 緩 沖 液 ［ 含50 mmol·L－1NaH2PO4、10 mmol·L－1Tris-HCl、 250 mmol·L－1NaCl、 苯甲基磺酰氟（PMSF） 1 000 μg·L－1和蛋白酶抑制劑（Aprotitin） 2 000 μg·L－1，pH 為8.0）］，超聲反復(fù)裂解， 10 000 r·min－1、 4 ℃離心提取總蛋白液。取50 μg 蛋白加入等體積5×上樣緩沖液。將樣品置于100 ℃沸水中熱變性5 min，按前述分組順序加樣，75 V、30 min，150 V、60 min 衡壓電泳，直至溴酚藍(lán)接近分離膠底部時，關(guān)閉電源。行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 上，5% 脫脂奶粉封閉2 h， TBST 充分洗膜，與p-Stat3、Stat3和VEGF 抗體4℃孵育過夜，TBST 充分洗膜；滴加HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育后TBST洗膜，暗室中顯影、采集圖像并分析各條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 各組細(xì)胞中IL-17A、 IL-17RA、Stat3 和VEGF 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果采用獨(dú)立樣本 非 參 數(shù)Mann-WhitneyU檢 驗(yàn)； 血 清IL-17、IL-6、 VEGF 和MMP-9 水平， 各組細(xì)胞中Stat3、p- Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)水平以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各種組織中IL-17A和IL-17RA表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：IL-17A 蛋白染色呈棕黃色，表達(dá)于腺上皮、單個核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。在NP組織中IL-17A 表達(dá)微弱，在BPH 和前列腺癌組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)。與NP 組織比較， BPH 組織中IL-17A 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與BPH 組織比較， 前列腺組織中IL-17A 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。IL-17RA 主要表達(dá)于腺上皮、單個核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。 與NP 組織比較， BPH 組織中IL-17RA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與BPH 組織比較，前列腺組織中IL-17RA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖1 （插頁五） 和圖2。

2.2各種組織中Stat3和VEGF的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示： Stat3 陽性顆粒呈棕黃色，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核也可見少量表達(dá)。與BPH 和NP 組織比較，前列腺癌組織中Stat3 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。 VEGF 中性顆粒也呈棕黃色，主要表達(dá)于前列腺上皮細(xì)胞中。與BPH 和NP組織比較，前列腺癌組織中VEGF 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖3 （插頁五） 和圖4。

2.3 IL-17A和IL-17RA表達(dá)與前列腺癌惡性程度的關(guān)系35例前列腺癌組織中，Gleason分級2～4分（高分化） 5 例，5～7 分（中分化） 22 例，8～10 分（低分化） 8 例。 統(tǒng)計不同Gleason 分級IL-17A 和IL-17RA 表達(dá)情況檢測結(jié)果顯示：隨著Gleason 分級增加（分化程度降低，惡性程度增加），IL-17A和IL-17RA表達(dá)水平均升高。見圖5（插頁五）和圖6。

圖2 各種組織中IL-17A 和IL-17RA 表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of IL - 17A and IL - 17RA in various tissues

2.4 Stat3和VEGF表達(dá)水平與前列腺癌惡性性度的關(guān)系隨著Gleason 分級增加（分化程度降低，惡性程度增加），Stat3 和VEGF 表達(dá)水平均升高。見圖7 （插頁五） 和圖8。

2.5 2組研究對象血清IL-17A、IL-6、VEGF和MMP-9水平ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與健康對照組比較， 前列腺癌組患者血清IL-17、 IL-6 和VEGF 水平明顯升高（P＜0.05），MMP-9 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測2組PC3細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)隨著培養(yǎng)時間的延長， 細(xì)胞愈合的程度越強(qiáng)。Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： 實(shí)驗(yàn)組中50 和100 μg·L－1IL-17A 重組蛋白作用細(xì)胞24 h 后，穿過Transwell 小室底的細(xì)胞數(shù)分別為（99.71±13.92）個·mm－2和（128.50±15.26） 個·mm－2； 實(shí) 驗(yàn)組PC3細(xì)胞的遷移距離明顯長于對照組（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。Transwell小室上、下室的細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后，典型的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)見圖9（插頁六）。

圖4 各種組織中Stat3 和VEGF 表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of Stat3 and VEGF in various tissues

2.7各組PC3細(xì)胞中Stat3、p-Stat3和VEGF蛋白表達(dá)水平隨著IL-17A 重組蛋白濃度的增加，PC3 細(xì)胞中Stat3、p-Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)水平升高，50 和100 μg·L－1IL-17A 作用PC3 細(xì)胞后細(xì)胞中Stat3、p-Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)水平明顯高于0 和20 μg·L－1IL-17A 組（P＜0.05）。見圖10。

3 討 論

圖6 前列腺癌組織中IL-17A 和IL-17RA 的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of IL-17A and IL-17RA in prostate cancer tissue

1995 年首先發(fā)現(xiàn)IL-17 及其第一個受體IL-17RA 以來，關(guān)于IL-17 的研究不斷深入。IL-17家族成員主要由輔助T 淋巴細(xì)胞17 （Th17） 產(chǎn)生，此外，γδT 細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞也可產(chǎn)生，目前研究較多的是 IL-17A 和 IL-17RA 。 IL-17A 與IL-17RA 結(jié)合后，通過系列轉(zhuǎn)導(dǎo)過程引起下游基因轉(zhuǎn)錄［10］。GEORE 等［11］發(fā)現(xiàn)：在BPH 組織和前列腺癌組織中IL-17A 及IL-17RA 表達(dá)水平升高。EUGENA 等［12］在 前 列 腺 增 殖 性 炎 性 萎 縮 病 變 中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)IL-17 的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。因?yàn)檠装Y刺激是促進(jìn)各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，如慢性胃炎發(fā)展成胃癌，長期的宮頸炎轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌等。 前列腺癌通常由長期BPH 演變而來，而炎癥是BPH 的典型病理改變。本課題組前期研究［5］ 結(jié)果表明：BPH 組織伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，提示BPH 是前列腺癌的直接前體。小鼠模型檢測發(fā)現(xiàn)：前列腺炎癥信號可以誘導(dǎo)或協(xié)同致癌信號促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展［15］。在BPH 組織中，炎細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子的產(chǎn)生同時增加， IL-17 家族成員 （IL-17A 、 IL-17E 和 IL-17F 及 IL-17RA 、IL-17RB 和IL-17RC） 的表達(dá)均有不同程度改變，尤其IL-17A表達(dá)水平升高最為明顯［5］，IL-17A是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子，ZHANG 等［13］證實(shí)：IL-17可促進(jìn)激素依賴型和去勢抵抗型前列腺癌的發(fā)展，其發(fā)生機(jī)制與促進(jìn)Stat3的表達(dá)有一定關(guān)聯(lián)。

圖8 前列腺癌組織中Stat3 和VEGF 的表達(dá)水平Fig.8 Expression levels of Stat3 and VEGF in prostate cancer tissue

本研究結(jié)果顯示：在BPH 組織和前列腺癌組織中IL-17A 表達(dá)水平升高，尤以前列腺癌組織中的表達(dá)水平升高最明顯，且在Gleason 評分高的組織其表達(dá)水平升高明顯，這也部分解釋了IL-17 具有 促 前 列 腺 癌 發(fā) 生 發(fā) 展 的 效 應(yīng) 。CHUNNINGHAM 等［14］和ZHANG 等［15］通 過 基因敲除IL-17RC，進(jìn)而阻斷IL-17A 的信號，發(fā)現(xiàn)前列腺癌生長受到抑制，其侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生率也明顯降低；利用IL-17A 阻斷劑或單克隆抗體也可抑制前列腺癌的生長，由此可見IL-17A 對前列腺癌具有促瘤效應(yīng)。

為了探討IL-17A 促進(jìn)前列腺癌增殖和遷移的機(jī)制，本研究采用不同實(shí)驗(yàn)方法檢測IL-17 下游信號的表達(dá)情況結(jié)果顯示：在前列腺癌組織中Stat3和VEGF 表達(dá)水平明顯高于BPH 組織，且隨著癌惡性程度的增加其水平進(jìn)一步升高；血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證明：前列腺癌患者血清IL-17A、IL-6 和VEGF 水平較健康對照者明顯升高，而MMP-9 水平無明顯變化。50 和100 μg·L－1IL-17A 重組蛋白具有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移的效應(yīng)； Western blotting 法檢測結(jié)果證實(shí)：隨著IL-17A 重組蛋白濃度的增加，Stat3、p-Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，50 和100 μg·L－1IL-17A 組PC3 細(xì)胞中Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)水平明顯高于0 和20 μ g·L－1IL-17A 組，說明IL-17 重組蛋白具有促進(jìn)前列腺癌增強(qiáng)及轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。

表1 2 組研究對象血清IL-17A、IL-6、VEGF 和MMP-9 水平Tab.1 Levels of IL-17A, IL-6, VEGF ,and MMP-9 in serum of subjects in two groups ［n=40,x±s,ρB/(μg·L-1)］

表2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同時間點(diǎn)2 組PC3 細(xì)胞遷移距離Tab.2 Migration distances of PC3 cells in two groups at different time points detected by scratch test （x±s，l/mm）

圖10 各組PC3 細(xì)胞中Stat3、p-Stat3 和VEGF 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.10 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of Stat3, p -Stat3, and VEGF proteins in PC3 cells in various groups

Stat3 在炎癥性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，可 被LPS 、 INF- γ 和 其 他 細(xì) 胞 因 子 激 活， IL-6、IL-10 和IL-11 與特異性受體結(jié)合可激活受體依賴的JAK1 和Tyk2，而Stat3 是JAKA1 下游基因，磷酸化后轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，調(diào)節(jié)Bcl-XL、Bcl-2、MYC 和SOCS3 轉(zhuǎn)錄［16］。Stat3 在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的宿主免疫 和 炎 癥 反 應(yīng) 不 容 忽 視，YOU 等［17］采 用Stat3 的小分子抑制劑明顯增強(qiáng)NK 和中性粒細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性，說明Stat3 具有促使腫瘤免疫逃逸效應(yīng)。Sta3 又是非常重要的原癌基因，在前列腺癌組織中持 續(xù) 激 活［18-19］。 IL-6 可 促 進(jìn)Stat3 的 磷 酸 化， 而IL-6 在前列腺癌組織中持續(xù)高表達(dá)，并與癌癥的惡性程度有關(guān)聯(lián)［20］。 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生大量IL-6 和TGF-β，共同誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞活化并分泌大量IL-17，IL-17可增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α 生成，反之，TNF-α 又可協(xié)同IL-6 正反饋激活Th17和γδT 細(xì)胞分泌IL-17，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大。IL-6 是IL-17A 的直接下游調(diào)節(jié)基因，IL-17A 持續(xù)激活可誘導(dǎo)IL-6 表達(dá)異常增加， 進(jìn)而激活Stat3，形成正反饋通路，共同作用促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示：小鼠前列腺原位癌模型中Th17 細(xì)胞浸潤明顯；在前列腺癌患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞增加明顯；當(dāng)Th17 細(xì)胞浸潤增加時，其分泌的IL-17 細(xì)胞因子水平明顯升高，而IL-17A 趨化炎癥細(xì)胞，發(fā)揮正反饋?zhàn)饔茫M(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。

在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中VEGF 是非常重要的生長因子，可調(diào)控血管的生成，而新生血管密度的增加是實(shí)體惡性腫瘤最重要的標(biāo)志之一，因此被認(rèn)為是腫瘤治療的靶標(biāo)。IL-17A 可選擇性增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF 表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促血管生成作用。IL-17A 可激活有絲分裂原活化的蛋白酶， 進(jìn)而使其下游信號轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和Stat3 激活，因此IL-17RA 在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)， 如膀胱癌、 大腸癌和肝癌等。 在喉癌組織中， IL-17 結(jié)合IL-17RA 可通過JAK/Stat3 信號通路調(diào)控VEGF 和MMP-9 的表達(dá)。

在前列腺癌組織，VEGF 表達(dá)增加與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，血清中VEGF 水平也可為腫瘤的預(yù)后提供可靠信息。在前列腺癌組織中， IL-17A 與其受體IL-17RA 結(jié)合后可誘使細(xì)胞因子IL-6 的持續(xù)合成和分泌，而Stat3 是IL-6 可靠的下游分子，因此存在IL-17A-IL-6-Stat3 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 通 路 激 活， 而VEGF 是Stat3 的 下 游 分 子， 當(dāng)Stat3 被激活后，p-Stat3 即刻轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA 啟動子序列結(jié)合并誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，使VEGF 合成及分泌增加，VEGF 一方面以旁分泌的形式在腫瘤局部產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管生成，減少腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血管的距離，供給實(shí)體腫瘤氧和營養(yǎng)物質(zhì)增加，腫瘤持續(xù)增殖甚至通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移至全身；合成的VEGF 另一方面分泌入血漿，作為內(nèi)分泌因子促進(jìn)血管生成及生長。在腫瘤微環(huán)境中，促血管生長和抑制血管生成趨化因子影響著腫瘤的生長速度，當(dāng)腫瘤細(xì)胞或組織中浸潤的炎癥細(xì)胞分泌促血管生成趨化因子較抑制血管生成的趨化因子增加時，則導(dǎo)致新生血管的增多并促進(jìn)腫瘤生長，而IL-17 可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中促血管生成的趨化因子（如VEGF） 的水平及活性，從而促進(jìn)腫瘤生長。

綜上所述，IL-17 既是Stat3 激活的誘發(fā)因子，又是炎細(xì)胞趨化和活化的炎癥因子，而這些炎細(xì)胞被活化進(jìn)一步釋放VEGF，出現(xiàn)了正反饋效應(yīng)，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚需深入研究。