黃芪注射液對人角質細胞增殖和黏附功能的影響及其治療銀屑病的作用機制

李 曉, 馬振卉, 王園園, 田亞萍

（1.吉林大學第一醫院皮膚科，吉林 長春 130021；2.山東省德州市人民醫院皮膚科，山東 德州 253000）

銀屑病是一種以紅斑和鱗屑為主要表現的慢性炎癥性皮膚病，病因復雜，目前認為由多基因遺傳調控、環境因素刺激和免疫機制介導等共同作用所致。在我國該病總患病率為0.123%，發病率高，易復發，病程較長，嚴重影響患者的身心健康［1］。人角質細胞（keratinocyte， KC） 異常增殖和細胞免疫系統異常是銀屑病特征性表現。活化T 細胞產生白細胞介素17 （interleukin-17，IL-17）、白細胞介 素 23 （interleukin-23， IL-23）、 干 擾 素 γ（interferon -γ， IFN-γ） 和腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 等［2-4］細胞因子促進KC增殖、棘層增厚和炎癥細胞浸潤；過度增殖的KC又通過自分泌和旁分泌方式釋放細胞因子增強T 細胞 活化， 從而誘發和加重銀屑病。 研究［5］顯 示：KC 的增殖和分化過程與細胞間黏附結構的重要組成部分β-連環蛋白（β -catenin） 有 密 切 關 聯。β -catenin 通過與細胞骨架的相互作用，協助細胞對細胞外的信號和影響做出反應。β-catenin 還可以在細胞核內充當轉錄因子，啟動促使細胞分裂的基因。在正常分化成熟的細胞中，β-catenin 大部分結合于細胞膜，細胞中游離的β-catenin 水平極低，不能進入細胞核調控相應基因表達［5-6］。

黃芪古稱 “補藥之長”，具有補氣固表、增強體質和扶正固本等功效，參與細胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應等過程，具有抗炎、抗氧化及調節機體免疫功能紊亂的作用［7-8］。王輝等［9］對結腸炎患者的臨床實驗研究表明：黃芪顆粒可能通過降低IL-17 和 IL-23 水平從而抑制炎癥反應。劉 丹 莉 等［10］研究顯示：黃芪甲苷對IL-17/IL-23信號通路存在一定的抑制作用。皮膚屏障受損是銀屑病加重的原因之一，KC 數占表皮細胞的80%，黃芪可能通過保護KC 改善皮膚屏障功能，抑制增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 的表達， 抑制細胞增殖， 使銀屑病患者表皮增殖速度減慢， 達到治療銀屑病的目的。研究［11-14］ 表明： 黃芪還能通過調節細胞中活性氧（active oxygen， ROS） 生 成、 核 因 子κB （NFκB）、 Janus 激酶信號導子和轉錄激活因子（JAK/STAT） 和磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（PI3/AKT） 等信號途徑產生抗氧化和抗炎活性，改善皮膚慢性炎癥反應。近年來，國內應用黃芪治療銀屑病取得較好效果，銀屑病皮疹消退時間明顯提前，治愈率明顯提高［15-20］，但未見黃芪注射液對KC 增殖和β-catenin 蛋白表達影響的相關研究報道。本研究為黃芪對銀屑病的治療作用機制研究提供初步的分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1細胞、藥物、主要試劑和儀器人永生化角質形成細胞（HaCaT 細胞） 為本實驗室凍存細胞。黃芪注射液（神威藥業集團有限公司， 每支裝10 mL，相當于原藥材20 g）。DMEM 培養基（美國Gibco 公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）， FastKing RT Kit 和SuperReal PreMix Plus （北京天根生化科技有限公司），兔抗人β -actin 單克隆抗體和山羊抗兔IgG （中國Biosharp 公司）。CO2培養箱、低速離心機和PCR擴增儀（美國Thermo 公司），倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 qPCR引物序列qPCR 引物由金唯智（蘇州） 生物科技有限公司合成。β-actin 引物序列：上游引物5′TCATGAAGTGTGACGTGGACATC，下游引物5′-CAGGAGGAGCAATGATCTTGATCT-3′； β -catenin 蛋 白 序 列： 上 游 引 物 5′-GGAGCCCTTCACATCCTAGG-3′，下游引物5′-GTGGCTCCCTCAGCTTCAAT-3′。

1.3各組HaCaT細胞增殖率的檢測首先確定黃芪對HaCaT 細胞增殖影響的有效濃度。取對數生長期、濃度為3 ×104mL－1的HaCaT 細 胞 懸 液2 mL，接種于6 孔細胞培養板，貼壁后加入10 倍濃度梯度稀釋為0、 0.01、 0.10、 1.00、 10.00 和100.00 g·L－1黃芪注射液培養24 h。對各組HaCaT細胞進行消化、計數，重復3 次，取平均值為有效濃度。在此基礎上，將黃芪注射液以2 倍濃度梯度稀釋，實驗組細胞加入不同濃度黃芪注射液，即不同濃度黃芪注射液組，同時設置空白組（添加培養基，不添加細胞及藥物） 和對照組（添加細胞，不添加藥物）。以2×103個細胞接種于96 孔細胞培養板， 設5 個復孔， 置于CO2培養箱培養24、 48 和72 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，置于培養箱內繼續孵育2 h。酶標儀檢測波長450 nm 處的吸光度（A） 值，實驗重復3 次，計算各組HaCaT 細胞增殖率。細胞增殖率= （實驗組A 值－ 空白組A 值） /（對照組A 值－空白A 值） ×100%，細胞抑制率=1－細胞增殖率。

1.4 HaCaT細胞總RNA提取和RNA逆轉錄為cDNA 實驗組加入1.0 g·L－1黃芪處理，對照組不加入黃芪。 細 胞 以3×105mL－1的 密 度 接 種 于10 cm 培養皿，設3 個復孔， 培 養24 和48 h 后 取1 mL 細胞懸液提取RNA， 紫外分光光度計測定RNA 濃度。按照cDNA 合成試劑盒進行實驗操作。分別配置DNA 去除反應體系、反轉錄反應體系，得到的cDNA 用于后續實驗，置于－20℃冰箱保存備用。

1.5 qPCR法檢測各組HaCaT細胞中β -catenin mRNA表達水平以β -actin 為 內 參， 按 照SuperReal PreMix Plus 試劑盒說明書進行實驗。根據實時結果Ct 值，采用2－△△Ct法對實驗結果進行計算， 計算β-catenin mRNA 相對于內參的表達水平。△△Ct=目的基因△Ct－內參基因△Ct。

1.6 Western blotting法檢測各組HaCaT細胞中β-catenin蛋白表達水平對照組（即0 g·L－1黃芪注射液組） 和實驗組（給予1.0 g·L－1黃芪注射液組） HaCaT 細胞以3×105mL－1培養24 h 貼壁后，培養細胞48 h， 胰蛋白酶消化收集細胞用于Western blotting 實 驗。 采 用Image J 軟 件 對SDSPAGE 圖譜進行蛋白灰度分析，計算各組HaCaT細胞中β-catenin 蛋白表達水平，β-catenin 蛋白表達水平=β-catenin 蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

1.7統計學分析采用GraphPad Prism 5.0 統計軟件進行統計學分析。 各組HaCaT 細胞增殖率、各組HaCaT 細胞中β-catenin mRNA 和蛋白表達水平以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以α=0.05 為檢驗水準。

2 結 果

2.1各組HaCaT細胞的增殖率以10 倍濃度梯度稀釋黃芪注射液（0、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 g·L－1） 依次處理HaCaT 細胞24 h，計數HaCaT 細胞，結果顯示： 1.00 g·L-1黃芪注射液組HaCaT 細胞增殖數降低（P＜0.01）（圖1）。在此基礎上， 2 倍濃度梯度稀釋黃芪注射液（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 和16.0 g·L－1） 加入實驗組，對照組和空白組不加入藥物。 各組分別經24、48 和72 h 孵育處理后，CCK-8法檢測各組HaCaT細胞增殖情況，結果顯示：與 對 照 組（0 g·L－1黃芪注射液） 比較，處理24和48 h后，1.00 g·L－1黃芪注射液組HaCaT 細胞增殖受到明顯抑制，而孵育72 h 后失去繼續抑制細胞增殖的效果（表1），因此后續實驗選取濃度為1.0 g·L－1黃芪注射液處理細胞24 和48 h。

2.2各組HaCaT細胞中β-catenin mRNA表達水平采用1.0 g·L－1黃芪注射液對HaCaT 細胞處理24 和48 h 后 檢 測 各 組HaCaT 細 胞 中β -catenin mRNA 表達水平，結果顯示：與對照組比較，24 h時1.0 g·L－1黃芪注射液組HaCaT 細胞中β-catenin mRNA 表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；48 h 時，與對照組比較，1.0 g·L－1黃芪注射液組HaCaT 細胞中β-catenin mRNA 表達水平降低（P＜0.01）。見圖2。

圖1 不同濃度黃芪注射液處理24 h 后各組HaCaT 細胞數Fig.1 Number of HaCaT cells in various groups after treated with different concertrations of Astragalus Injection for 24 h

表1 CCK-8 法檢測不同濃度黃芪注射液處理24、48 和72 h后各組HaCaT 細胞數Tab.1 Number of HaCaT cells in various groups after treated with different concertrations of Astragalus Injection for 24，48 ，and 72 h detected by CCK-8 method （n＝3，x±s）

2.3對照組和1.0 g·L－1黃芪注射液組HaCaT細胞中β-catenin蛋白表達水平1.0 g·L－1黃芪注射液處理HaCaT 細胞48 h 后， 與對照組比較，1.0 g·L－1黃芪注射液組HaCaT 細胞中β-catenin 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。見圖3。

圖2 處 理24 和48 h 后 對 照 組 和1.0 g·L-1 黃 芪 注 射 液 組HaCaT 細胞中β-catenin mRNA 表達水平Fig.2 Expression level of β-catenin mRNA in HaCaT cells in 1.0 g·L-1 Astragalus Injection group after treated for 24 and 48 h

圖3 Western blotting 法檢測處理48 h 后對照組和1.0 g · L－1 黃芪注射液組HaCaT 細胞中β-catenin 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of β- catenin protein in HaCaT cells in control group and 1.0 g · L－1 Astragalus Injection group after treated for 48 h detected by Western blotting method

3 討 論

銀屑病是免疫介導的炎癥性皮膚病，尚無特效藥物進行治療，其主要組織病理學主要特征為KC過度增殖，這可能與細胞間的黏附連接結構β -catenin 蛋白異常表達有關。β-catenin 蛋白是一種胞內糖蛋白，具有雙重功能：一是作為附著連接的組成部分，與鈣黏蛋白結合形成復合體參與細胞間連接；二是作為信號分子，是Wnt/β-catenin 信號通路的重要環節，在胚胎發育和腫瘤發生中起重要作用。β-catenin 蛋白選擇何種途徑發揮作用，與不同配體競爭性結合密切相關。最新研究［21-22］表明：Wnt/β-catenin 信號通路可能在銀屑病中起到調節角質形成細胞分化與增殖的作用。劉國剛等［22］發現：β-catenin 蛋白在尋常型銀屑病皮損區中的異位表達率明顯高于正常組織。因此，β-catenin 蛋白可作為評估銀屑病發展的參考指標之一。

低濃度黃芪可以抑制KC 增殖。研究［23］顯示：黃芪注射液能夠抑制銀屑病患者表皮分離KC 的生長，且濃度增加抑制作用越明顯，與本實驗結果略有不同。本研究結果顯示：當濃度達到1.0 g·L－1后，黃芪的抑制作用基本進入平臺期，隨著濃度的升高，抑制效果略有降低，隨著時間的增加，黃芪注射液對KC 的增殖抑制作用逐漸減弱，72 h 時基本喪失抑制作用。 β -catenin 蛋白在48 h 轉錄和表達水平均明顯降低， 72 h 時，抑制效應均減弱。這一結果可能與黃芪注射液藥效成分較多有關。雖然黃芪注射液中的主要成分（皂苷類、黃酮類和多糖類） 相對穩定，但是黃芪至少還有十余種其他有效成分的生理作用仍需繼續探索，不同產地的黃芪在成 分 上 的 微 小 差 異 也 不 容 忽 視［23］。 KC 中的β -catenin 蛋白可能存在一個臨界響應閾值，黃芪的有效濃度只起到了激活作用，之后會隨時間自動衰減，這種現象有待于未來深入研究。另外，銀屑病患者臨床表現為典型的點狀出血，存在真皮淺層血管炎和微循環障礙。李炎夏等［24］研究顯示：將黃芪與維胺酯合用，可明顯起到抑制角化，改善微循環的作用，并且更為有效地促進皮損部位的修復。HUH 等［25］研究顯示：黃芪中的芒柄花黃素可作為血液增強劑，產生更大的毛細血管芽生區域，細胞增殖和遷移也更多，由此證實黃芪具有改善血液微循環的作用。在皮膚病治療方面，黃芪則具有改善局部微循環，促進成纖維細胞和膠原蛋白的合成、修復角質形成細胞、調節細胞因子，調整免疫活性的作用。采用黃芪根煮水提取物，作用于有開放傷口的小鼠背側，微觀組織學觀察發現黃芪能夠加速基底細胞生長，刺激細胞外基質的合成，抑制炎癥反應，加速皮膚傷口愈合［26-28］。但無法在體外細胞學實驗中觀察到，因此本研究結果未展現出黃芪的全部有效性。

本研究采用細胞學實驗探討黃芪對銀屑病治療作用的結果顯示：起始濃度大于1.0 g·L－1黃芪注射液可以對KC 異常增殖和黏附功能起到抑制作用，抑制效應可能隨時間衰減，進一步分離提取黃芪不同的有效成分并進行深入研究，將為應用黃芪治療銀屑病提供分子生物學依據。