攜載miRNA-124 納米粒子經鼻吸入對缺血性腦卒中模型大鼠的神經保護作用

郝如彬, 王浩天, 楊麗華, 馬 春, 李淑玲, 李欣欣, 李鐵術

（1.長春中醫藥大學中醫學院中醫內科學教研室，吉林 長春 130117；2.吉林大學藥學院生物藥學系微生物與生化藥學教研室，吉林 長春 130021；3.長春中醫藥大學附屬醫院老年病研究所，吉林 長春 130021；4.長春中醫藥大學附屬醫院老年病科，吉林 長春 130021）

大腦中動脈阻塞可導致大面積腦梗死和擴大性腦水腫，引起腦卒中，腦卒中是目前全球臨床死亡的第二大原因［1］。發生腦梗死后，缺血半影區內的神經細胞在短暫的時間內具有功能恢復的潛在可能性［2］。微小RNA （micro RNA，miRNA） 是一種短序列的具有特異性調控功能的單鏈RNA［3］，其中miRNA-124 是發育成熟的中樞神經系統（central nervous system， CNS） 中表達最豐富的miRNAs 之一［4］，與神經元的分化、成熟和存活有密切關聯。 神經系統疾病的臨床研究［5］顯示：miRNA-124 常用作腦卒中后神經保護和功能恢復，而且miRNA-124 在神經系統抗炎中起重要作用［6］，miRNA-124 是目前報道最多的具有神經保護和恢復功能的miRNA。為了使藥物順利穿過血腦屏障到達腦部，本課題組采用了經鼻吸入給藥的方式，以神經通道繞過血腦屏障，并采用聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly （ethyleme glycol） -poly（lactic-co-glycolic acid），PEG-PLGA］ 納米粒子包載藥物防止水解，采用RVG29 修飾增強該藥物的神經靶向性。目前尚無關于RVG29 修飾納米粒子進行經鼻吸入給藥的方式遞送miRNA 干預腦卒中的報道。

本 研 究 采 用RVG29 修 飾 納 米 粒 子［7］包 載miRNA，加強了其對鼻黏膜中嗅神經和三叉神經的靶向能力，使藥物更易在神經組織附近富集，最終評價鼻吸入miRNA-124 對缺血性腦卒中大鼠動物模型的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器90 只成年SD 大鼠， 雌 雄 各 半， 12～15 周 齡、 體 質 量 為250～300 g，購于遼寧長生生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK （遼） 2015-0001。飼養于吉林大學藥學院動物中心，恒溫（23±2） ℃，相對濕度（54±2） %，暗/光循環12 h，可自由飲水和進食，適應性喂養1 周。

馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物［（maleimide-poly （ethylene glycol） -poly （lacticco-glycolic acid），Mal-PEG-PLGA］，單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸聚乙醇酸（monomethoxypolyethylene glycol polylactic polyglycolic acid， MePEG-PLGA）和PLGA （濟南岱罡生物工程有限公司），亞精胺和1，1'-雙十八烷基-3，3，3，3-四 甲 基 吲 哚 三碳花菁碘化物（DiR）（美國西格瑪公司），RVG29-Cyspeptide 和PEG-PLGA-maleimide （Mal-PEG-PLGA，相對分子質量為5 000～20 000）（吉林省新近紀生物科技有限公司），miRNA-124 （上海吉瑪公司），局灶性大腦中動脈缺血再灌注損傷（middle cerebral artery occlusion ， MCAO）， 栓線（北京西濃科技有限公司），水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠），鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業股份有限公司），白細胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、 腫 瘤 壞 死 因 子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6 （interleukin-1β，IL-6） 和白細胞介素4 （interleukin-4，IL-4） ELISA 試劑盒（美國Peprotech 公司）。Zetasizer 3000 （英國馬爾文儀器公司），TEM H-7650 透射電子顯微鏡（日本日立公司），低溫離心機（德國Eppendorf 公司），去離子水儀（美國PALL 公司）， 高速離心機（德國Eppendorf 公司）。 本研究中實驗方法經吉林大學和長春中醫藥大學動物倫理審查委員會批準。

1.2 RVG29修飾的PEG-PLGA納米粒子的制備采用復乳法制備攜載miRNA-124 的PEG-PLGA 納米粒子。miRNA-124 與亞精胺在無RNase 的水中以10∶1 比例混合形成復合物。將18 mg PLGA 和2 mg 馬來酰亞胺PEG-PLGA 分別溶解于2 mL 二氯甲烷（dichloromethane， DCM） 中， 然后將亞精胺和miRNA-124 形成的絡合物加入上述DCM 溶液中，超聲60 s 形成乳液。將乳液加入20 mL 體積比為2.5% 的PVA 水溶液中繼續攪拌，旋轉蒸發除去有機溶劑。采用21 000 g 離心濃縮45 min，采用去離子水洗滌3 次。利用馬來酰亞胺-硫醇相互作用將RVG29 肽偶聯到納米粒子表面。 將過量RVG29 肽孵育8 h，離心（12 000 g、15 min） 去除未反應的肽。 采用同樣的步驟制備不含miRNA-124 的空白納米粒子。去除DiR 標記的納米粒子是通過向油相中加入DiR 生成的，其余制備過程與上述相同。 采用Quant-iT ?RiboGreen kit 試劑盒測定納米粒子的包封率，利用動態光散射（dynamic light scattering，DLS） 測量納米粒子的粒徑和zeta電位。采用透射電鏡觀察納米粒子形態表現。

1.3納米粒子經鼻吸入腦后的生物分布對比RVG29 修飾的PEG-PLGA 納米粒子和非RVG29修飾的PEG-PLGA 納米粒子在大鼠體內的生物分布， 向大鼠施用載有近紅外染料DiR 的RVG29-PEG-PLGA 和PEG-PLGA 納米粒子，分別通過經鼻吸入給藥的方式進行大鼠滴鼻給藥，左右鼻孔輪流滴入，每個鼻孔滴入5 μL。分別在給藥后0.5、2.0、4.0 和6.0 h 測定大鼠腦組織中DiR 值并進行可視化處理， 其中熒光強度單位為ng （熒光物質）·g－1（腦組織）［10］。

1.4缺血性腦卒中大鼠模型的建立采用改良Zea-Longa 線栓法建立MCAO 大鼠模型。大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后，仰臥位固定，術野局部消毒，縱切頸部右側皮膚，暴露右側頸總動脈（common carotid artery， CCA）、 頸 外 動 脈（external carotid artery， ECA） 和 頸 內 動 脈（internal carotid artery， ICA），暫時夾住ECA 和ICA， ECA 結扎離斷， 在ECA 近心端剪血管1/4大小的切口，采用4-0 單絲尼龍拴線從ECA 插入ICA，并由ICA 腔緩慢進入顱內，栓線進入長度距ICA 和ECA 的分叉處1.8～2.0 cm，阻斷大腦中動脈，縫合，維持體溫直至大鼠蘇醒。2 h 后，抽出MCAO 栓線進行腦缺血再灌注， 完成MCAO 造模。假手術組大鼠僅暴露ICA 和ECA 分支［8］。

1.5動物實驗分組和給藥方式各組動物造模前均進行藥物干預。分為假手術組、模型組、法舒地爾組、miRNA-124 經鼻吸入給藥組、PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEGPLGA/miRNA-124 經 鼻 吸 入 給 藥 組， 每 組6 只。每組在建模前第7 天、第5 天和第3 天，法舒地爾組大鼠腹腔注射5 mg·kg－1·d－1法舒地爾，共3 次；各類經鼻吸入給藥的方式為大鼠滴鼻給藥，左右鼻孔輪流滴入相應藥物，每個鼻孔滴入5 μL 。最后一次給藥1 h 后，采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，所有大鼠造模后24 h，麻醉取材。所有程序均符合有關動物倫理道德規范。

1.6各組大鼠神經功能障礙評分檢測再灌注24 h 后，參 照Zea-Longa 5 級4 分 法［5］進 行 神 經 功能評分。評分標準：0 分，無顯著神經功能缺損；1 分，提尾時，病灶對側前肢不能完全伸展；2 分，向缺血對側轉圈；3 分，向對側傾倒；4 分，無自主運動或意識障礙。神經功能評分1～3 分視為造模成功的大鼠模型，納入本研究中。

1.7各組大鼠腦組織含水量測定大鼠開顱取腦組織后，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準確稱質量并計為濕質量，然后將腦組織置于恒溫干燥箱烘干，并準確稱取腦組織計為干質量，腦組織含水量= （濕質量－干質量） /濕質量×100%。

1.8 ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF- α、IL-1β、IL-4和IL-6水平各組大鼠麻醉取腦前，先采集腹主動脈血液樣本［12］， 室溫下靜置30 min，4 ℃離心，收集上清液，采用ELISA 技術測定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-6 水平，操作過程嚴格參照ELISA 試劑盒說明書［13］進行。

1.9統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠神經功能障礙評分、腦組織含水量和血清中TNF-α、IL-1β、IL-4 及IL-6 水平均符合正態分布，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差檢驗齊性時組間比較采用LSD-t法，方差檢驗不齊時組間比較采用Dunnett’s T3 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RVG29-PEG-PLGA納米粒子的表征RVG29-PEG-PLGA 納米粒子的平均粒徑為204 nm， 以miRNA-124 計微小RNA 的包封率為28.2%。透射電鏡下可以觀察到納米粒子的整體形態均勻，偏近圓形。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察RVG29-PEG-PLGA 納米粒子形態表現(Bar=1 μm)Fig.1 Morphology of RVG29-PEG-PLGA nanoparticles observed with transmission electron microscope (Bar=1 μm)

2.2納米粒子經鼻吸入腦后的生物分布鼻內給藥納米粒子后，大腦的嗅球、皮質區、紋狀體、中腦、海馬、小腦和腦干中納米粒子的蓄積在時間和空間上都有很大不同：在所分析的所有腦區域中，納米粒子給藥后30 min，嗅球、皮質區、紋狀體、中腦、海馬、小腦和腦干中均有較強的藥物蓄積。2 h 后，除皮質區外，海馬、腦干和小腦等區域中RVG29 修飾的納米粒子均顯示了更強的藥物蓄積和遞送能力。4 和6 h 后，腦干中RVG29 修飾的納米粒子的蓄積持續較非RVG29 修飾的納米粒子遞送能力更強。可視化數據圖譜中，RVG29 修飾組所有腦區域中有效負載藥物濃度高于非修飾組。核酸藥物濃度在進行經鼻吸入遞藥后趨于降低或可大致維持4 h，RVG29 顯示了較強的靶向作用，尤其是針對腦干的有效遞送。見圖2 （插頁六）。

2.3各組大鼠神經功能評分假手術組大鼠無神經功能障礙；與假手術組比較，模型組大鼠神經學評分明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，法舒地 爾 組、 miRNA-124 經 鼻 吸 入 給 藥 組 、PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠神經學評分降低（P＜0.05）。與法舒地爾組比較， RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠神經學評分降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠神經功能評分Fig.3 Neurological function scores of rats in various groups

2.4各組大鼠腦組織含水量與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，法舒地爾組、miRNA-124 經鼻吸入給藥組、PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠腦組織含水量降低（P＜0.05）。與法舒地爾組比較， RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠腦組織含水量降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織含水量Fig.4 Water contents in brain tissue of rats in various groups

2.5各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-4水平與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-4、IL-6、 TNF-α 和IL-1β 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，法舒地爾組、miRNA-124 經鼻吸入給藥組、PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥 組大鼠 血清中IL-4、IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.05）。 與法舒地爾組比較，RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠血清中IL-4、IL-6、TNF-α 和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

3 討 論

在受到包括腸胃代謝和肝臟分解等首過效應和血腦屏障的生物學作用后，miRNA-124 保護神經的藥效學作用大幅降低，使得miRNA 等藥物達到受損神經元部位的效力降低。核酸藥物易被蛋白酶類分解，因此本課題組結合納米藥物載體技術，將miRNA-124 進行包載以減少非靶向組織對藥物的降解和破壞，并選用非侵入性的鼻內給藥方式［9］，提高藥物的腦靶向性和減少全身的不良反應。目前常用的納米藥物載體有慢病毒載體和合成聚合物載體，考慮到病毒載體有一定的不良反應，且靶向修飾相對困難，因此本課題組選擇人工合成的PEGPLGA 為 載 體， 該 載 體 合 成 簡 單， 大 小 可 控［10］，免疫原性低容易修飾［11］并保存，生物相容性好［12］且可重復性高［13］。如果能順利完成miRNA-124 的腦內遞送，則將有可能極大提升未來臨床干預腦部疾病用藥的可行性。由于血腦屏障的存在，類似于miRNA-124 的核酸藥物經口服或者靜脈給藥來干預中樞神經系統疾病受到限制，生物利用度降低。將藥物直接腦內注射操作不便，也易給患者造成心理和生理上的痛苦。經鼻吸入腦的主要路經是納米藥物通過鼻黏膜以及鼻上皮細胞，到達嗅神經和三叉神經附近，沿著神經通道，轉運至腦部［15］，從而解決了血腦屏障對藥物遞送的屏蔽作用。因此經鼻吸入給藥最大的優勢是具有可以繞過血腦屏障，同時兼具無創給藥，藥物利用度高和全身不良反應少的優勢［14］。

由于鼻纖毛的清除運動，使裸露的miRNA 容易被清除，且裸露的miRNA 在黏液中不穩定容易被降解。因此，本課題組選用PEG-PLGA 這種具有較低生物毒性和良好生物相容性的納米載藥平臺［16］進行藥物包載，減少藥物在組織傳遞過程中被降解，增強藥物在黏膜中的轉運效率。考慮到藥物在鼻黏膜中對神經的靶向性弱，因此對納米藥物采用RVG29 進行修飾，RVG29 是基于狂犬病病毒糖蛋白中提取的有29 個氨基酸序列的嗜神經性病毒衍生肽，有報道［17］顯示RVG29 來源于修飾靜脈遞送藥物從而提高腦靶向性，但藥物從循環系統進入 腦 需 要 經 過 血 腦 屏 障［18］， 雖 然 報 道［19］顯 示RVG29 修飾后均增加藥物在腦組織中的蓄積，但是通過經鼻吸入給藥直接避開血腦屏障的給藥方式效率可能更高。因為目前尚無通過RVG29 介導經鼻吸入給藥的體內藥效學作用研究。所以本研究在該基礎上考察了RVG29 修飾后的PEG-PLGA 納米粒子［19］在大鼠腦組織中的生物分布和大鼠MCAO缺血性腦卒中的藥效學作用，納米粒子經鼻吸入腦組織后的生物分布結果表明：通過RVG29 修飾的納米藥物可以更多地積累在腦組織中， 證明RVG29 修飾的納米粒子有更強的藥物蓄積和遞送能力。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-4 水平Tab.1 Levels of serum TNF- α, IL-1, IL-6, and IL-4 of rats in various groups [n=6，x±s，ρB /(ng·L-1)]

本研究結果顯示：模型組大鼠的神經功能評分明顯高于假手術組，在不同時間采用藥物干預的各組大鼠神經功能評分均較模型組明顯降低，表明miRNA-124 在改善神經功能方面有積極作用。有無RVG29 修飾的納米粒子在大鼠腦內的分布圖可以清晰地看出RVG29 在藥物靶向中的作用，RVG29 可有效地持續藥物作用，使之停留并蓄積于腦干，尤其是給藥后的6 h 內，RVG29 均保持了優異的經鼻吸入腦能力，未來將其開發成適宜的納米粒子靶向物可能為臨床用藥提供一種全新的選擇。

腦水腫是液體在腦組織中的病理性聚積，是局部腦梗死后的形態表現改變之一，腦缺血后腦組織含水量升高，腦水腫規律與神經功能缺損的嚴重程度一致［20］，本研究結果顯示：假手術組大鼠腦組織含水量高于模型組。與模型組比較，法舒地爾組、 miRNA-124 經鼻吸入給藥組、 PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEGPLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠腦組織含水量降低， 且以RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124經鼻吸入給藥組效果最明顯。

發生腦缺血后，腦組織中會出現免疫炎性反應，巨噬細胞在腦缺血再灌注損傷中發揮重要作用［21］，巨噬細胞會根據不同的環境變化反應而分化為不同的類型［22］，巨噬細胞釋放的血清炎癥因子水平可在一定程度上反映早期卒中嚴重度及預后［23］。其中TNF-α、IL-1β 和IL-6 與M1 型巨噬細胞活性有關聯［24］，IL-4 與M2 型巨噬細胞活性有關聯［25］。炎癥的發生會促進組織內平衡的恢復，但急性炎癥也會加重缺血性損傷［26］。本研究結果顯示： 與對照組比較， 模型組大鼠血清中IL-4、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均明顯升高；與模型組比較， 法舒地爾組、 miR-124 經鼻吸入給藥組、PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組和RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組大鼠血清中IL-4、TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低，且以RVG29-PEG-PLGA/miRNA-124 經鼻吸入給藥組效果最明顯。

本研究結果顯示： 腦損傷后TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-4 和M1 型相關的促炎因子水平升高，用藥后其水平降低， 確實起到了抑制炎癥的作用。IL-4 不但可以刺激活化B 細胞和T 細胞增殖，促進炎性反應，也可以誘導M2a 型巨噬細胞產生白細介素10 （interleukin-10， IL-10）、 趨化因子配體3（CCL13、） 趨化因子配體17 （CCL17） 和趨化因子配體22 （CCL22） 等抑炎及組織修復因子［27］，可以保護大腦免受急性缺血性損傷，起到抗炎的作用；大鼠腦損傷后外周血中IL-4 水平升高，用藥后IL-4 水平降低，IL-4 的這種表現考慮為腦損傷前期，IL-4 主要表現為與促進炎癥反應有關聯。

綜上所述，RVG29 修飾后的納米粒子有更好的腦內分布作用，其能更長久地蓄積核酸到腦干中，RVG29-PEG-PLGA 納米粒子展示了較好的鼻吸入腦遞送能力，其攜載的miRNA-124 對大鼠缺血性腦卒中有保護作用， 并且攜載遞送miRNA-124 還改善了腦缺血大鼠神經功能、腦水腫情況及炎癥因子TNF-α、 IL-1β、 IL-4、 IL-6 的釋放，發揮對腦缺血再灌注損傷的保護作用。