BTg-3 對甲狀腺濾泡癌細胞增殖、侵襲和遷移及WNT/β-catenin信號通路的影響

杜靜海, 郭 欣

（河北醫科大學附屬唐山工人醫院頭頸外科，河北 唐山 063000）

甲狀腺濾泡癌的發生發展與癌基因和抑癌基因表達失調關系密切，抑癌基因功能缺失或發生突變可導致甲狀腺濾泡癌的發生發展［1］。B 細胞轉位基因（BTg） 家族成員為抑癌基因，該家族成員最重要的生理功能為抑制細胞的增殖。BTg-3 為該家族成員之一， 也具有抑制惡性腫瘤發生發展的特性［2］，研 究［3］顯 示：BTg-3 在 多 種 惡 性 腫 瘤 中 具有抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移的作用。本課題組［4］對甲狀腺乳頭狀癌組織中BTg-3 的表達進行研究發現：甲狀腺乳頭狀癌組織中BTg-3 呈低表達，過表達BTg-3 可通過抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的上皮-間質轉化抑制細胞增殖、 侵襲和遷移過程， 但BTg-3 在甲狀腺濾泡癌發生發展中的作用及其機制尚不清楚。本研究觀察甲狀腺濾泡癌組織和細胞中BTg-3 表達情況及過表達BTg-3 對甲狀腺濾泡癌細胞增殖、侵襲和遷移過程中WNT/β-連環蛋白（βcatenin） 信號通路的影響，探討其在甲狀腺濾泡癌發生發展中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1組織標本選擇2019 年1 月—12 月本院頭頸外科收治的甲狀腺濾泡癌組織和甲狀腺濾泡腺瘤組織標本各80 例， 甲狀腺濾泡癌患者平均年齡為（54.32±7.16） 歲， 其中男性14 例， 女性66 例；甲狀腺濾泡腺瘤患者平均年齡為（53.64±7.35） 歲，男性16 例，女性64 例。2 組患者年齡和性別構成比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：均首次確診；行手術治療；術前未進行其他相關治療；病理證實為甲狀腺濾泡癌或甲狀腺濾泡腺瘤。排除標準：其他惡性腫瘤者；甲狀腺其他疾患者；其他類型甲狀腺癌者。

1.2細胞、 主要試劑和儀器甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞和甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 細胞（上海中科院細胞庫）。兔抗人BTg-3 多克隆抗體、兔抗人Ki67 多克隆抗體、兔抗人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA） 多克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin） 多克隆抗體、兔抗人上皮性鈣黏蛋白（E-cadherin） 多克隆抗體、兔抗人WNT1 多克隆抗體、兔抗人β-catenin 多克隆抗體、兔抗人糖原合成激酶3β （GSK3β） 多克隆抗體和兔抗人磷酸化GSK3β （p-GSK3β） 多克隆抗體（美國Abcam 公司），BTg-3 慢病毒過表達載體和陰性對照載體（上海吉瑪公司），胎牛血清、胰蛋白酶、杜爾伯科改良伊格爾（DMEM） 培養基和Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國DBI 公司），DAB 試劑盒、CCK-8 試劑盒和結晶紫（美國Gibco 公司）， Transwell 小室（美國Millipore 公司），Matrigel 膠（美國BD 公司）。酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3免疫組織化學法檢測甲狀腺濾泡癌組織和甲狀腺濾泡腺瘤組織中BTg-3表達情況將甲狀腺濾泡癌組織和甲狀腺濾泡腺瘤組織石蠟塊切成4 μm 厚切片，采用免疫組織化學法檢測甲狀腺濾泡癌組織和甲狀腺濾泡腺瘤組織中BTg-3 蛋白表達情況：將石蠟切片常規脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液修復抗原，加入過氧化氫去除可能產生干擾的過氧化物酶，加入一抗兔抗人BTg-3 多克隆抗體（1∶100） 過夜孵育，加入二抗（1∶5 000） 孵育45 min，加入DAB顯色3 min，蘇木素染色5 min，氨水返藍5 s，顯微鏡下觀察免疫組織化學染色情況。結果判斷：根據陽性細胞染色程度和范圍進行分級。染色程度：無染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐 色 為3 分。 染 色 范 圍： 顯 色 細 胞 數＜25%為1 分，25%≤顯色細胞數≤50% 為2 分，50%≤顯色細胞數≤75% 為3 分， 顯色細胞數＞75%為4 分。總積分=顯色程度積分+顯色范圍積分。總積分0～3分判定為陰性，總積分≥4分判定為陽性［5］。

1.4細胞培養將甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞和甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 細胞置于含胎牛血清的DMEM 培養基中培養，每2～3 d 換液1 次，培養至細胞達80% 以上融合時采用胰蛋白酶進行消化，并進行傳代培養，取第3 代CGTHW-1 和Nthy-ori細胞進行后續研究。

1.5 Western blotting法檢測甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞和甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori細胞中BTg-3蛋白表達水平每組設7 個復孔，每孔2 mL，培養24 h，加入細胞裂解液，提取總蛋白，采用Bradford 法測定組織蛋白濃度，制備SDS-PAGE 凝膠， 取50 μg 蛋白上樣， 80 V 恒壓電泳， 濕法轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗：兔抗人BTg-3多克隆抗體（1∶100）， 過夜孵育； 加入二抗（1∶5 000） 孵育1 h，顯影、曝光后，采用Image-Pro Plus6.0 軟件分析條帶灰度值，以β-actin 為內參照，計算目標蛋白表達水平。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.6細胞分組和轉染將甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞隨機分為空白對照組、陰性對照組和BTg-3 過表達組。轉染前1 d，取3 組CGTHW-1 細胞接種到6 孔板中，每組設7 個復孔，每孔4×105個細胞，加入含胎牛血清和雙抗的DMEM 培養基過夜培養；細胞達85% 以上融合時進行轉染。BTg-3 過表達組每孔加入10 μL 轉染試劑和4 μg BTg-3 過表達載體培養，陰性對照組加入10 μL 轉染試劑和4 μg 陰性對照載體培養，空白對照組不轉染。6 h 后更換培養基，24 h 后移去病毒液加入完全培養基，再培養48 h 用于后續研究。采用Western blotting 法檢測轉染后各組CGTHW-1細胞的轉染效率。轉染效率=轉染細胞數/總細胞數×100%。

1.7 CCK-8法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞增殖活性取轉染48 h 后甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞，加入到96 孔培養板， 每孔3×103個細胞，每組設7 個復孔， 分別于24、 48 和72 h 時， 每 孔 加 入10 μL CCK-8 溶 液， 培 養2 h，采用酶標儀于波長450 nm 處測定各組細胞吸光度（A） 值，以A 值代表細胞增殖活性。

1.8平板克隆實驗檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞克隆形成率取轉染48 h 的CGTHW-1 細胞，接種到6 孔板上，每孔500 個細胞，每組設7 個復孔， 加入完全培養基， 培養14 d，見細胞克隆時棄去上清液，加入多聚甲醛靜置30 min，加入結晶紫靜置30 min，自然晾干，拍照觀察，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.9 Transwell法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞侵襲和遷移能力侵襲能力檢測：取轉染48 h的CGTHW-1 細胞，制成細胞懸液。Transwell 上室采用Matrigel 膠包被。 取200 μL 重懸細胞（含8×104個細胞） 加入Transwell 上室，置入培養箱中 培 養24 h， 擦 去 小 室 細 胞， 多 聚 甲 醛 固 定30 min，結晶紫染色30 min，顯微鏡下拍照，觀察并計數200 倍視野下侵襲細胞數。遷移能力測定：Transwell 小室上室不用Matrigel 膠包被，其他步驟同侵襲能力檢測實驗。

1.10 Western blotting法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中Ki67、PCNA、Vimentin、E-cadherin、WNT1、β -catenin、GSK3 β和p-GSK3β蛋白表達水平取轉染48 h 的甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞，調整細胞濃度為2×105mL－1，接種至6 孔板中，每組設7 個復孔，每孔2 mL，培養24 h，加入細胞裂解液，提取總蛋白，BCA 法測定各組細胞蛋白濃度，經電泳、濕法轉膜，脫脂奶粉封閉2 h， 加入一抗兔抗人Ki67 多克隆抗體（1∶200）、兔抗人PCNA多克隆抗體（1∶200）、兔抗人Vimentin多克隆抗體（1∶200）、兔抗人E-cadherin多克隆抗體（1∶200）、兔抗人WNT1 多克隆抗體（1∶300）、兔抗人β-catenin 多克隆抗體（1∶300）和兔抗人GSK3β 多 克 隆 抗 體（1∶300）、 兔 抗人p-GSK3β 多克隆抗體（1∶300） 過夜孵育，加入二抗（1∶2 000） 孵育2 h，ECL 發光，Image圖像分析系統分析條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目標蛋白表達水平。目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.11統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。2 種組織中BTg-3 陽性表達率和各組細胞克隆形成率組間比較采用χ2檢驗，各組細胞增殖活性、侵襲細胞數、遷移細胞數和甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細 胞 中 BTg-3、 Ki67、 PCNA、Vimentin 、 WNT1 、 β -catenin 、 p-GSK3 β 及E-cadherin 蛋白表達水平以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1甲狀腺濾泡癌組織和甲狀腺濾泡腺瘤組織中BTg-3陽性表達率甲狀腺濾泡癌組織中BTg-3 陽性表達率（30.00%，24/80） 低于甲狀腺濾泡腺瘤組織（91.25%，73/80）（χ2=62.864，P＜0.01）。見圖1 （插頁七）。

2.2甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞和甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori細胞中BTg-3蛋白表達水平甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞中BTg-3 蛋白表達水平（0.14±0.03） 低于甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 細胞（0.90±0.08）（t=34.484，P＜0.01）。見圖2。

2.3各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中BTg-3蛋白表達水平與空白對照組（0.12±0.04） 和陰性對照組（0.14±0.03） 比較，BTg-3 過表達組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞中BTg-3 蛋白表達水平（0.93±0.06） 升高（P＜0.01）。見圖3。

2.4各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞增殖活性與空白對照組和陰性對照組比較，各時間點BTg-3 過表達組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞增殖活性降低（P＜0.05）。見表1。

圖2 Western blotting 法檢測甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞和甲狀腺濾泡上皮Nthy-ori 細胞中BTg-3 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of BTg-3 protein in thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells and thyroid follicular epithelial Nthy-ori cells detected by Westen blotting method

圖3 Western blotting 法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中BTg-3 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of BTg-3 protein in thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups detected by Western blotting method

表1 各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups （n=7,±s）

表1 各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups （n=7,±s）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control BTg-3 over-expression FP Proliferation activity(t/h) 24 0.48±0.05 0.49±0.06 0.40±0.05*△5.942 0.010 48 0.87±0.08 0.85±0.09 0.63±0.06*△20.757＜0.001 72 1.44±0.12 1.45±0.11 0.95±0.09*△49.587＜0.001

2.5各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞克隆形成率與空白對照組和陰性對照組比較，BTg-3 過表達組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞克隆形成率降低（P＜0.05）。見圖4 （插頁七） 和表2。

2.6各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞侵襲和遷移細胞數與空白對照組和陰性對照組比較，BTg-3 過表達組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞侵襲和遷移細胞數減少（P＜0.05）。見圖5 （插頁七）和圖6 （插頁七） 及表2。

表2 各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數Tab.2 Clone formation rates, number of invasion cells, and number of migration cells of thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups （n=7，±s）

表2 各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細胞克隆形成率、侵襲細胞數和遷移細胞數Tab.2 Clone formation rates, number of invasion cells, and number of migration cells of thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups （n=7，±s）

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control BTg-3 over-expression FP Clone formation rate（η/%）29.64±2.79 31.02±2.84 14.25±2.61*△80.310＜0.01 Number of invasion cells 215.42±19.46 213.54±20.31 73.24±15.67*△134.711＜0.01 Number of migration cells 209.51±15.62 207.84±16.02 84.19±14.32*△153.737＜0.01

2.7各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中Ki67、PCNA、Vimentin和E-cadherin蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，BTg-3 過表達組甲狀 腺濾泡癌CGTHW-1 細胞 中Ki67 、 PCNA 和E-cadherin 蛋白表達水平 降 低 （P＜0.05 ），E-cadherin 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖7和表3。

2.8各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中WNT1、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，BTg-3 過表達組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1 細 胞 中WNT1 、β -catenin 和p-GSK3β 蛋 白 表 達 水 平 降 低（P＜0.05）。見圖8 和表4。

表3 各組CGTHW-1 細胞中Ki67、PCNA、Vimentin 和E-cadherin 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of Ki67, PCNA, Vimentin ,and E-cadherin proteins in CGTHW-1 cells in various groups（n=7，x±s）

表4 各組CGTHW-1 細胞中WNT1、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of WNT1, β-catenin, GSK3β and p-GSK3β proteins in CGTHW-1 cells in various groups（n=7，x±s）

圖7 Western blotting 法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中Ki67、PCNA、Vimentin 和E-cadherin 蛋白表達電泳圖Fig.7 Electrophoregram of expressions of Ki67, PCNA,Vimentin, and E-cadherin proteins in thyroid follicular carcinoma CGTHW-1 cells in various groups detected by Western blotting method

圖8 Western blotting 法檢測各組甲狀腺濾泡癌CGTHW-1細胞中WNT1、β-catenin、GSK3β 和p-GSK3β 蛋白表達電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of expressions of WNT1,β -atenin, GSK3β ,and p-GSK3β proteins in thyroid follicular cacinoma CGTHW-1 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

BTg 家族成員除具有抑制細胞增殖能力外，還具有調控細胞生長、促進細胞分化和成熟、對受損傷的DNA 進行修復等功能。BTg-3 為BTg 家族成員之一，也具有抑制細胞增殖、調控細胞生長、修復受損傷的DNA、 促進細胞分化和成熟等作用；在BTg-3 的結構域中存在1 個 特 異 性 的N 端 和A 盒，N 端和A 盒共同作用于E2FI，可有效抑制E2FI-DPI 轉錄復合物的生成， 阻止癌細胞進入S 期，從而對癌細胞的增殖發揮抑制作用［6-7］。目前有不少學者對BTg-3 在惡性腫瘤中的作用進行研究，如下調BTg-3 表達可促進非小細胞肺癌細胞增殖、抑制細胞凋亡［8］；靶向下調BTg-3 表達可促進腎癌細胞的生長和遷移［9］；過表達BTg-3 可抑制結直腸癌的表型和侵襲行為［10］；調節BTg-3 甲基化狀態可抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡［11］。

上述研究均表明：BTg-3 作為抑癌基因在多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和遷移中發揮重要作用。本研究結果顯示：甲狀腺濾泡癌組織和細胞中BTg-3表達水平降低；過表達BTg-3 可降低甲狀腺濾泡癌細胞增殖活性、細胞克隆形成率、侵襲和遷移細胞數， 降低細胞中Ki67、 PCNA 和Vimentin 蛋白表達水平，升高E-cadherin 蛋白表達水平。Ki67 在增生細胞核中普遍存在，為增生細胞核的標志性抗原，可比較好地反映細胞核的增殖能力。PCNA 為細胞增殖蛋白，可反映細胞的增殖狀態。Ki67 和PCNA 為惡性腫瘤生長相關蛋白，其水平升高可反映惡性腫瘤細胞增殖能力增加。上皮-間質轉化為介導惡性腫瘤侵襲遷移的關鍵步驟，其特點為使上皮細胞失去特性，轉化為具有間充質和侵襲表型，上皮-間質轉化程度可反映惡性腫瘤細胞的侵襲遷移能力。在上皮-間質轉化過程中，上皮細胞標志分子E-cadherin 表達水平降低，間質細胞標志分子Vimentin 表達水平升高。本研究結果表明：過表達BTg-3 可抑制甲狀腺濾泡癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，BTg-3 也可抑制甲狀腺濾泡癌增殖、侵襲和遷移，與本課題組前期研究［4］結果相似，表明BTg-3 在甲狀腺濾泡癌中具有抑癌作用， 考慮BTg-3 對甲狀腺濾泡癌細胞增殖有抑制作用，故根據本研究結果分析BTg-3 對甲狀腺濾泡癌侵襲和遷移的影響可能也與細胞增殖受到抑制有關聯，本研究未對其進行詳細探討，擬在未來研究中進行專項研究。

本研究結果顯示：過表達BTg-3 可降低甲狀腺濾 泡 癌 細 胞 中WNT1、 β-catenin 和p-GSK3β 蛋 白表達水平。WNT1 和β-catenin 為WNT/β-catenin 信號通路的主要成員，胞漿中β-catenin 水平可決定WNT 信號傳遞， 為WNT 的主要效應分子，GSK3β 在 靜 息 狀 態 下 可 抑 制β -catenin 表 達，GSK3β 被磷酸化后失去活性，升高胞漿中β-catenin水平［12-13］。本研究結果表明：過表達BTg-3 可抑制甲狀腺濾泡癌細胞中WNT/β -catenin 信號通路。WNT/β-catenin 信號通路在惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程中發揮重要作用，該通路的異常激活與甲狀腺癌的發病和進展關系密切［14］，WNT/β-catenin 可通過靶向調控細胞的上皮-間質轉化影響惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移過程［15-16］。BTg-3 可通過WNT/β-catenin 信號通路發揮作用，如BTg-3 過表達通過調節AKT /GSK3β/β-catenin信號轉導抑制卵巢上皮癌細胞的增殖和侵襲［17］；BTg-3 過表達通過Wnt /β-catenin 信號通路抑制大腸癌SW480 細胞的增殖和侵襲［18］。 結合WNT/β -catenin 信號通路在甲狀腺癌發病中的作用和BTg-3 可通過WNT/β-catenin 發揮作用的結論并分析本研究結果表明：BTg-3 可能通過抑制WNT/β -catenin 信號通路激活，從而抑制甲狀腺濾泡癌細胞上皮-間質轉化過程，抑制其增殖、侵襲和遷移能力，在甲狀腺濾泡癌發生發展過程中發揮抑癌作用。

綜上所述，甲狀腺濾泡癌組織和細胞中BTg-3表達水平降低， 過表達BTg-3 可能通過抑制WNT/β-catenin 信號通路抑制甲狀腺濾泡癌細胞的增殖、侵襲和遷移。