復合誘變選育高產洛伐他汀紅曲菌

陳秉梅 孫麗娟 陳巧如

摘 要： 為了提高紫色紅曲霉菌M21發(fā)酵產洛伐他汀的含量，首先確定了紫外線、亞硝酸和氯化鋰單誘變劑的最適誘變劑量，再采用紫 外 亞 硝酸和紫 外 氯 化鋰復合誘變劑對出發(fā)菌株M21進行誘變選育。結果表明：最適處理劑量為紫外線照射時間90 s，亞硝酸處理時間30 min，氯化鋰處理濃度0.8‰。紫外 氯化鋰復合誘變劑在最適處理劑量下對原始出發(fā)菌株M21的復合誘變效果更佳，得到了3株高產突變菌株ULi17、ULi19和ULi26，洛代他汀產量比出發(fā)菌株分別提高75.2%、60.4%和67.0%，遺傳穩(wěn)定結果顯示ULi17產量最高、遺傳性狀較為穩(wěn)定，因此將ULi17確定為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

關鍵詞： 洛伐他汀;紫色紅曲霉菌;誘變選育

中圖分類號： Q939.97文獻標志碼： A文章編號： 0253-2301（2020）06-0007-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.002

Breeding of High-yield Lovastatin from? Monascus? Strains by Complex Mutagenesis

CHEN Bing-mei， SUN Li-juan， CHEN Qiao-ru

（Fujian Vocational College of Bioengineering， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract：In order to improve the content of lovastatin produced by the fermentation of? Monascus purpureus? M21， the optimal mutagenesis dose of single mutagen such as ultraviolet ray， nitrous acid and lithium chloride was firstly determined， and then the complex mutagens ofultraviolet? ray-nitrous acid and ultraviolet ray-lithium chloride were used to mutagenize the original strain M21. The results showed that the optimal treatment dose was the irradiation time ofultraviolet? ray being 90 s， the treatment time of nitrous acid being 30 min， and the concentration of lithium chloride being0.8‰.? The complex mutagen of ultraviolet ray and lithium chloride had better effect on the complex mutagenesis of the original strain M21 under the optimal treatment dose， and the three high-yield mutant strains ULi17， ULi19 and ULi26 were obtained. The production of lovastatin was 75.2%， 60.4% and 67.0% higher than that of the original strain， respectively. The results of genetic stability showed that ULi17 had the highest yield and stable genetic characters， so ULi17 was identified as the original strain for the subsequent studies.

Key words：Lovastatin;? Monascus purpureus ; Mutation breeding

近年來，高膽固醇血癥發(fā)生率正以驚人的速度增長，可引發(fā)多種心血管疾病并發(fā)癥，因此嚴重威脅到公眾健康。由于使用降脂藥物治療高膽固醇血癥存在較多副作用，人們更青睞于通過服用食品或功能性產品來達到降脂目的[1] 。目前市售的降脂藥“脂必妥”和“血脂康”中的主要成分即來源于紅曲。研究表明，紅曲降脂作用的主要功效成分為其次級代謝產物洛伐他汀，作為膽固醇合成途徑中HMG-CoA還原酶的競爭性抑制劑，洛伐他汀可以有效減少或阻斷內源性膽固醇的合成[2] 。因此，傳統(tǒng)的紅曲制造企業(yè)紛紛將目光投向具有高附加值的功能性紅曲上。常見產洛伐他汀真菌有紅曲霉和土曲霉，但產量不適宜大規(guī)模生產，因此提高洛伐他汀的產量具有重要意義[3] 。

優(yōu)良菌株是高產洛伐他汀的基礎和關鍵，因此對菌種進行改良勢在必行。菌種改良的傳統(tǒng)誘變方法主要有以紫外線、X射線、γ射線、離子束等為主的物理誘變和以堿基類似物、脫氨劑、烷化劑、羥化劑、金屬鹽類等為主的化學誘變，以及以噬菌體、轉座子為誘變媒介的生物誘變[4] 。隨著新技術的推廣，激光、微波、常溫等離子體[5] 誘變技術在微生物育種中得到應用。并且，隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，基因重排技術[6] 、基因工程育種技術[3] 等在高產洛伐他汀紅曲菌的定向選育中也展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。然而傳統(tǒng)的理化誘變具有操作簡單、速度快、突變率高等特點，目前仍是獲得優(yōu)良菌株的有效途徑，因而不可替代[4] 。但是長期反復使用單一誘變劑誘變之后，菌株易產生“疲勞效應”，引起菌種生長周期延長、活性代謝產物減少等。為了提高誘變效果，在實踐過程中常常采用兩種或兩種以上誘變劑交替或同時處理出發(fā)菌株[7] ，因此本研究采用了紫外線、亞硝酸、氯化鋰為單一誘變劑確定誘變劑的最適處理劑量之后，采用紫外線加亞硝酸和紫外線加氯化鋰復合誘變劑對出發(fā)菌株紫色紅曲菌M21進行誘變選育，通過遺傳穩(wěn)定性研究，最終挑選出產量高、遺傳性狀穩(wěn)定的高產突變菌株ULi17作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株，為功能性紅曲的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 紫色紅曲霉菌 Monascus purpureus? M21由本實驗室從市售紅曲米中篩選得到并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200g·L-1 ，葡萄糖20g·L-1 ，瓊脂條20g·L-1 ，自然pH。

液體種子培養(yǎng)基： 可溶性淀粉40g·L-1 ，麥芽糖40g·L-1 ，蛋白胨20g·L-1 ， MgSO 4·7H 2O 0.7g·L-1 ，K 2HPO 4 0.8g·L-1 ，自然pH。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米粉 40g·L-1 ，麥芽糖20g·L-1 ，蛋白胨20g·L-1 ，玉米粉15g·L-1 ，NaNO 3 3g·L-1 ，ZnSO 4·7H 2O 1g·L-1 ， MgSO 4·7H 2O? 1g·L-1 ， KH 2PO 4 2g·L-1 ，自然pH。

以上培養(yǎng)基均于121℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將分離純化得到的菌株，劃線接種于PDA斜面，28℃培養(yǎng)7 d后，加入10 mL無菌生理鹽水，用接種環(huán)刮下斜面上的孢子，并用漩渦振蕩器振蕩后，用4層擦鏡紙過濾除去菌絲，再用血球計數(shù)板于顯微鏡下計數(shù)，將孢子懸液調整成10 6個·mL-1 。

1.2.2 培養(yǎng)方法 液體發(fā)酵培養(yǎng)：將斜面菌種制成孢子懸液，取孢子懸液按2%的接種量接種于液體種子培養(yǎng)基中（裝液量50 mL/250 mL三角瓶），30℃，150r·min-1 ，培養(yǎng)2～3 d至液體顏色微紅，作為種子液。按5%的接種量將種子液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量50 mL/250 mL三角瓶），30℃，150r·min-1 進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)酵產物中洛伐他汀的檢測 發(fā)酵液的預處理：取發(fā)酵液0.4 mL，加入甲醇1.6 mL，超聲振蕩20 min，50℃水浴2 h， 5 000 r·min-1 離心10 min，取上清液經0.45 μm有機膜過濾，濾液用來檢測洛伐他汀含量。

洛伐他汀含量的檢測：采用高效液相色譜法（HPLC）測定。色譜條件為AngilentTC C18 反相色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為甲 醇∶? 水（0.15%磷酸）= 80∶ 20;流速1.0mL·min-1 ;檢測波長238 nm;進樣體積20 μL;柱溫25℃。

1.2.4 紫外誘變 取孢子懸液至直徑9 cm的無菌平皿中，每皿裝液量10 mL，在磁力攪拌下，打開皿蓋于15 W紫外燈下30 cm處分別照射30、60、90、120、150、180 s;取經紫外線處理過的菌懸液0.5 mL，依次稀釋至 10-3 ～ 10-5 ，立即浸入冰水中暗室保存15 min，以抑制孢子內參與突變體修復的各種酶類的活性，有利于提高突變率。在紅燈下取稀釋液0.2 mL涂布于PDA平板，每個稀釋度作3個平行;按相同方法稀釋涂布未經紫外線處理的孢子懸液于PDA平板作對照。平板于30℃培養(yǎng)箱中倒置避光培養(yǎng)3 d，記錄平板菌落數(shù)，計算致死率。

致死率（%）=（對照平板平均菌落數(shù)-誘變處理后平均菌落數(shù)）/對照平板平均菌落數(shù)×100%

1.2.5 亞硝酸誘變 取孢子懸液2 mL放入密封的無菌小試管中，加入pH 4.5的醋酸緩沖液和0.1mol·L-1 亞硝酸鈉溶液各1 mL，于30℃下分別水浴處理0、10、15、20、25、30、35 min后加入Na 2HPO 4溶液（pH 8.6） 20 mL使pH下降到6.8，以終止反應[8] 。稀釋涂布平板后放入30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，記錄菌落數(shù)，計算致死率。

1.2.6 氯化鋰誘變 取0.2 mL孢子懸液均勻涂布于含氯化鋰濃度分別為 0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰和1‰的平板培養(yǎng)基中，以不含氯化鋰的平板為空白對照，放入30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計菌落數(shù)，計算致死率。

1.2.7 紫外 亞硝酸復合誘變 根據(jù)紫外和亞硝酸誘變致死率試驗結果選擇最適紫外線照射時間和亞硝酸處理時間，將制備好的孢子懸液經紫外線照射后取2 mL放入密封的無菌小試管中進行亞硝酸誘變處理至最適時間后稀釋涂布平板，30℃避光培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)變化，挑取生長速度較快或形態(tài)變化較大的單菌落，轉接到PDA斜面培養(yǎng)7 d后，進行液體發(fā)酵復篩。

1.2.8 紫外 氯化鋰復合誘變 根據(jù)紫外和氯化鋰誘變致死率試驗結果選擇最適紫外線照射時間和氯化鋰濃度，將制備好的孢子懸液經紫外線照射后取0.2 mL均勻涂布于含最適濃度的氯化鋰平板培養(yǎng)基上，于 30℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)變化，挑取生長速度較快或形態(tài)變化較大的單菌落，轉接到PDA斜面培養(yǎng)7 d后，進行液體發(fā)酵復篩。

1.2.9 突變菌株篩選方法 初篩：從紫外 亞硝酸和紫外 氯化鋰復合誘變后的平板培養(yǎng)基上分別挑選30株生長較快或菌落形態(tài)與原菌株有明顯變化的單菌落。

復篩：將初篩得到的突變菌株轉接到PDA斜面上，28℃培養(yǎng)7 d，制備孢子懸液，進行液體發(fā)酵培養(yǎng)10 d，用HPLC法測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量，挑選出產量較高的菌株。每一突變菌株各做3個平行組。

1.2.10 誘變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗 將復篩得到的高產洛伐他汀突變菌株接種于PDA斜面上，28℃培養(yǎng)7 d后作為第1代，第1代斜面菌落轉接至新的PDA斜面上，28℃培養(yǎng)7 d后為第2代，以此類推連續(xù)傳至第5代，每代液體發(fā)酵培養(yǎng)10 d后測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量，并記錄。

2 結果與分析

2.1 誘變劑量的選擇

紫外線、亞硝酸和氯化鋰單誘變劑對紫色紅曲霉菌株的誘變致死情況見 圖1～ 3。為了獲得較高的正突變率，方便突變菌株的進一步篩選，一般選取致死率為90%[9] 時的處理劑量確定為各誘變劑的最佳誘變劑量。因此各誘變劑最合適的處理劑量為：紫外線照射時間選擇90 s，亞硝酸處理時間為30 min，氯化鋰處理濃度為0.8‰。

2.2 紫外 亞硝酸復合誘變正突變株的篩選

選取紫外線照射90 s、亞硝酸處理時間30 min進行復合誘變，誘變后平板上的突變菌株菌落大小不一，多數(shù)長勢緩慢退化，菌苔稀薄，少數(shù)生長較快。經初篩獲得復合誘變突變菌株30株，編號為 UH1～ UH30，分別對其進行液體發(fā)酵培養(yǎng)并測定發(fā)酵產物中洛伐他汀的含量，結果見圖4。由圖4可以看出，紫外 亞硝酸復合誘變有11株突變株的洛伐他汀產量較出發(fā)菌株M21有所提高。其中UH6的產量提高最為明顯（83.2g·L-1 ），比出發(fā)菌株提高了57.6%。

2.3 紫外 氯化鋰誘變正突變菌株的篩選

氯化鋰是一種堿金屬鹵化物，單獨使用沒有明顯的誘變效果，需要與其他的誘變劑配合處理后才具有協(xié)同作用[10] 。選取紫外照射90 s、氯化鋰濃度0.8‰進行復合誘變，將處理后菌株在PDA平板上培養(yǎng)，其生長形態(tài)大小不均一，少數(shù)菌落生長較快，多數(shù)菌落長勢緩慢，菌苔稀薄。挑取長勢較好或與原始出發(fā)菌株形態(tài)有較大差異的單菌落30株，編號為 ULi1～ ULi30，搖瓶發(fā)酵復篩并測定發(fā)酵液中洛伐他汀含量，結果見圖5。從圖5可以看出，通過紫外 氯化鋰復合誘變，有9株正突變株的洛伐他汀產量較出發(fā)菌株M21有所提高。其中ULi17、ULi19、ULi26三株突變株的洛伐他汀產量提高較大，分別為92.5、84.7、88.2mg·L-1 ，較出發(fā)菌株分別提高了75.2%、60.4%和67.0%，且均較紫外 亞硝酸復合誘變的高產突變株UH6產量高，由此可見紫外 氯化鋰復合誘變效果較紫外 亞硝酸復合誘變效果更佳。

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

經誘變處理得到的高產突變株遺傳性狀可能不穩(wěn)定，易發(fā)生回復突變或突變性狀衰退甚至消失，導致產量下降等問題，因而需要驗證其傳代穩(wěn)定性，以便選擇連續(xù)傳代后性狀穩(wěn)定的高產突變菌株作為工業(yè)化生產的出發(fā)菌株。對突變菌株ULi17、ULi19、ULi26分別連續(xù)傳代5次，結果見表1。由表1可知，ULi19和ULi26傳代過程中產量降幅大，高產洛伐他汀的性狀不穩(wěn)定。ULi17降幅小，遺傳性狀較為穩(wěn)定，因此選擇ULi17作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

3 結論

紫外誘變能引起堿基互換、錯配、缺失或移碼突變，還能使相鄰的兩個嘧啶共價連接形成嘧啶二聚體，導致DNA雙鏈出現(xiàn)扭曲而變形，使堿基錯配引起突變或死亡[11] 。而化學誘變劑能夠引起堿基的替換、缺失等DNA的結構改變，從而引起遺傳物質的變異。紫外誘變技術設備簡單、使用方便、誘變效果好，因此常常與化學誘變劑聯(lián)合使用，以期提高誘變效果。因此，本研究首先探討了紫外線、亞硝酸、氯化鋰單誘變劑對紫色紅曲霉菌株誘變致死情況，確定了最適處理劑量為紫外線照射時間90 s、亞硝酸處理時間30 min、氯化鋰處理量0.8‰。然后采用紫外線加亞硝酸和紫外線加氯化鋰復合誘變劑在最適處理劑量下對原始出發(fā)菌株進行誘變選育，結果表明紫外 氯化鋰復合誘變效果更佳，得到了3株高產突變菌株ULi17、ULi19和ULi26，洛伐他汀產量比出發(fā)菌株分別提高了75.2%、60.4%和67.0%。這可能是由于這兩種誘變劑的特異性作用位點不同，聯(lián)合應用引起紅曲霉菌體內遺傳物質的多種變異，導致誘變效果明顯提高。其中，ULi17洛伐他汀產量更高、遺傳更穩(wěn)定，因此將ULi17確定為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。擬在后續(xù)試驗中，通過進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，提高洛伐他汀的產量，同時降低有毒物質桔霉素含量，為功能性紅曲的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

參考文獻：

[ 1] 肖連冬，王志強.降膽固醇紅曲霉菌株的分離及其降解性能研究[J].中國釀造，2015，34（5）：74-77.

[ 2]王明娟，劉靜，康帥，等.紅曲藥材中洛伐他汀含量及指紋圖譜的質量評價[J].中國藥事，2018，32（9）：1226-1231.

[ 3]沈小瑞，王鈺，陳達偉.紅曲霉 LovD 基因的克隆及轉基因高產洛伐他汀菌株篩選[J].生物學雜志，2019，36（4）： 23-25.

[ 4]趙川，羅建軍，陳少華，等.微生物菌種改良篩選新技術研究進展[J].生物技術通報，2009（S1）：118-121.

[ 5]祁田甜，張嬋，胡濟美，等.常壓室溫等離子體誘變技術選育高產Monacolin K紫色紅曲霉突變株[J].食品科學，2015，36（9）：66-70.

[ 6]李亮，林娟，葉秀云.利用基因組重排技術選育高產洛伐他汀紅曲菌株[J].福州大學學報（自然科學版），2017，45（5）：754-758.

[ 7]馬少麗，劉欣.常用誘變育種技術在我國真菌育種上的應用[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2014，44（1）：42-44.

[ 8]施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學[M].北京：科學出版社，2009：59-65.

[ 9]CHEN B M，XU X P，HOU Z G，et al.Mutagenesis of a New Isolated Strain? Bacillus? sp.B26 for Producing （ R ）- α -Hydroxyphenylacetic Acid [J].? Chinese Journal of Chemical Engineering ，2011，19（4）：636-643.

[10]劉頤屏.抗生素菌種選育的理論和技術[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1992：45.

[11]諸葛健.工業(yè)微生物育種學[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006：77-78.

（責任編輯：林玲娜）