益生菌發酵果蔬制品研究進展

王亞琴，高振鵬，2，3*

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100；2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室，陜西楊凌 712100；3.陜西省農產品加工工程技術研究中心，陜西楊凌 712100）

益生菌是指人食用后對身體產生有益作用的活菌，通過改善和調節腸道微生物平衡來促進人體的健康[1]。益生菌在發酵乳制品方面應用廣泛，但由于部分人群有乳糖不耐癥，這極大地限制了乳制品的消費。研究發現果蔬汁/漿也是益生菌良好的發酵載體，由于果蔬中含有豐富的營養成分，如維生素、多酚和多糖等，不僅為益生菌在果蔬汁/漿中的存活和生長提供了豐富的基質，而且通過益生菌發酵使營養物質發生轉化，豐富了產品的口感，增加了產品的營養功能特性[2-3]。益生菌發酵果蔬制品能改善人體腸道菌群，進而改善便秘、乳糖不耐癥，抑制一些腐敗菌在腸道內定植等。此外，我國是果蔬生產大國，但果蔬深加工率一直比較低，將益生菌引入果蔬深加工產業，不僅能提高我國果蔬深加工的比例，而且還能極大地改善國民飲食健康狀況[4]。

目前市面上已有發酵果蔬制品，且中華人民共和國輕工業行業標準QB/T5356—2018 果蔬發酵汁已于2019年7 月1 日實施，行業標準規定果蔬發酵制品中活菌數要達到1×105CFU/mL 以上[5]。雖然相關的標準已經頒布，但是目前在市場上銷售的活菌型果蔬制品相對較少，由于含有活菌的益生菌發酵果蔬制品在貨架期會出現活菌數下降、后酸化等問題[6]，還需要進一步完善。此外，益生菌發酵果蔬制品的生物轉化機制與其在人體內及果蔬汁中生物轉化后的代謝產物對人體的互作機制還不清楚。本文就益生菌發酵果蔬制品的研究進行了綜述，以期能在益生菌發酵果蔬制品進行市場化應用推廣方面起到一定的指導作用。

1 益生菌發酵果蔬制品的研究現狀

1.1 菌種篩選

益生菌菌種的篩選對果蔬發酵制品品質起決定性作用，既要滿足其能在果蔬制品中生長，使發酵得到的產品感官品質好，又要滿足活菌濃度在產品貨架期達到國家行業標準的要求；此外，還需要適應人體腸道的高酸、高膽鹽環境，能在腸道中定植、改善腸道菌群結構。益生菌篩選時還需考慮單一菌種與混合菌種發酵果蔬制品的差異，既要考慮產品口感，也要考慮菌種之間是否有拮抗作用。因此，益生菌菌種的篩選在果蔬制品發酵過程中起關鍵性作用。

Lu 等[7]分別利用瑞士乳桿菌L10、副干酪乳桿菌L26及鼠李糖乳桿菌HN001 發酵楊桃汁，發酵過程中在無菌條件下連續取樣進行理化和微生物指標分析，篩選得出瑞士乳桿菌是較好的楊桃汁發酵菌種。孟掉琴等[8]通過益生菌耐酸、耐膽鹽、產酸能力及復合菌株之間的拮抗作用篩選出最適的菌種組合，即嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和發酵乳桿菌進行混菌發酵蘋果濁汁，所得果汁的色澤、組織狀態和口感都比較好。何嘉敏等[9]通過拮抗作用選出了嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌來發酵復合果蔬汁，以活菌數和SOD 值為指標選出了菌種的最佳配比。杭鋒等[10]通過耐酸、耐膽鹽性質篩選出能在人體胃腸道中存活的菌株，并進行單一菌株及混合菌株發酵復合果蔬汁比較，最終確定混菌發酵復合果蔬汁的品質高于單一菌種發酵。

綜上所述，混菌發酵對某些產品的口感風味有一定的改善，但是大多數產品在貨架期內確保一定的活菌濃度方面存在問題。益生菌發酵果蔬制品中益生菌的生長活力主要取決于所用菌種的種類、pH 值以及最終產品所含的乳酸濃度等[11]。益生菌發酵果蔬產品過程中常選用的菌種有植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌及干酪乳桿菌等。

1.2 產品穩定性

益生菌發酵果蔬制品既包含果蔬自身的營養物質，也包括發酵過程中轉化產生的代謝產物以及益生菌菌體細胞。益生菌發酵果蔬制品加工方式不當時，會使產品在貨架期會出現沉淀、褐變、變酸等現象，造成產品品質降低。果蔬汁中各種成分在發酵過程中也會發生相互作用，降低其穩定性。大部分果蔬汁在貨架期間會發生顏色變化，主要原因是色素在果蔬汁貯藏過程中發生降解，影響果蔬產品中色素降解的物質是VC、還原糖、總酚等[12]。徐萌萌[13]通過測定胡蘿卜飲料的粒徑、黏度、電位及離心沉淀率等變化來表征益生菌發酵胡蘿卜飲料穩定情況，研究發現貯藏溫度和時間對益生菌發酵胡蘿卜飲料穩定性的影響很小，各項指標的變化范圍較小。通過測定胡蘿卜飲料中性多糖、蛋白質和糖醛酸的變化，證實這些因素對胡蘿卜飲料貯藏穩定性的影響，研究發現低溫貯藏會延緩色素降解以及VC、還原糖、總酚的作用，從而維持色素的穩定。果蔬汁中多酚的抗氧化、蛋白質的溶解性及糖基化都會受到蛋白質、多糖與多酚兩兩相互作用的影響，此外，三者間的相互作用在果蔬汁中也能引起體系不穩定，使果蔬汁渾濁或沉淀[10]。

益生菌發酵果蔬制品最重要的標志之一就是活菌濃度，益生菌在貨架期會出現活菌濃度下降，導致活菌濃度達不到國家標準最低要求，圍繞此問題，科研工作者開展了大量研究。如丘裕[14]測定了4 ℃下貯藏28 d 的干酪乳桿菌和植物乳桿菌發酵的南瓜汁、火龍果汁以及混合汁的pH、可滴定酸度和活菌數，研究結果表明，南瓜汁及火龍果汁中的植物乳桿菌和干酪乳桿菌的活菌數維持在2.2×109～1.8×109，新陳代謝緩慢，且pH 和酸度變化不大，能夠保證益生菌活菌數量在貨架期內達到標準要求，總體來說，低溫對益生菌發酵的貯藏起到積極作用。ZHU等[15]研究了舊金山乳桿菌發酵蘋果汁、橙汁和番茄汁貯藏期間pH 和活菌數的變化，結果顯示三種果汁的pH 都呈下降趨勢，主要原因是舊金山乳桿菌在果汁中產生了一定量的乳酸，pH 較低的環境更適于益生菌的生長，三種果汁中的活菌數雖然有所下降，但均達到了國家標準規定的水平。

水果、蔬菜品種繁多，每種果蔬所含成分以及含量都有很大的差異，近年來學者們研究了許多關于控制益生菌發酵果蔬汁的穩定性技術，例如酶解、均質、熱燙等[9]。酶解及均質在工業生產中由于成本等問題沒有普遍應用，而熱燙相對來說成本低，在工業中普遍被應用，但是對產品品質的傷害比較大，且作用機理尚不明確，需要進一步研究。此外，益生菌在產品貨架期穩定性也隨果蔬品種的變化發生改變。

1.3 營養成分變化

益生菌發酵果蔬汁不僅能發揮益生菌的功效，也能使果蔬汁中的營養成分發生變化。果蔬產品本身就是低脂肪、低蛋白、糖類化合物和維生素含量豐富，其中維生素是人體維生素的主要來源，經過益生菌的發酵，一些營養成分發生變化，轉化成機體更容易吸收的營養成分。例如益生菌可以將蛋白質轉化為小分子多肽、大分子多糖轉化為低聚多糖。徐萌萌[13]通過對益生菌發酵胡蘿卜汁的營養成分測定分析，結果顯示發酵胡蘿卜汁中含有豐富的礦物質、維生素，其中谷氨酸含量最高，具有低脂肪、低蛋白的特點。胡蘿卜汁經發酵后蛋白質含量降低，脂肪含量基本保持不變，蛋白質降低的原因是發酵過程中蛋白質為菌體生長提供了能量。王萬升[16]將益生菌發酵胡蘿卜原漿和益生菌發酵雪梨原漿中的營養成分進行比較，發現有機酸、B 族維生素、粗蛋白以及氨基酸含量有所變化，經益生菌發酵之后胡蘿卜和雪梨漿中的乳酸含量增加了十倍左右，且酸性環境中益生菌更易于在腸道中定植。粗蛋白、氨基酸和B 族維生素在發酵前的殺菌過程中損失嚴重，基本檢測不出來，但經益生菌發酵后，它們的含量都增加。高振鵬等[17]采用混合益生菌發酵復合蘋果汁，得出發酵使復合蘋果汁中總糖含量下降，可滴定酸含量上升。也有研究發現，用植物乳桿菌S-811發酵仙人掌梨汁能對其中所含的維生素產生保護作用，這種保護作用可能與pH 值的下降有關[18]，因為維生素在酸性環境中更穩定。

可見，益生菌發酵果蔬制品能夠使果蔬營養成分發生生物轉化或生物降解，產生更易于機體吸收的營養成分，增加了益生菌對腸道的改善功能，使發酵果蔬制品的營養更加豐富。

1.4 動力學及貨架期預測

果蔬種類繁多，成分復雜，益生菌在不同品種果蔬汁中的生長情況不盡相同，即使相同的益生菌發酵不同品種果蔬時，發酵動力學變化也比較大，因此，建立適合不同果蔬特性的益生菌發酵動力學，對于指導發酵過程意義重大。發酵動力學主要研究各種環境因素與微生物代謝隨時間變化的相互作用規律。益生菌發酵果蔬動力學主要通過分析菌種生長、產物合成和底物消耗來研究發酵果蔬動態變化，掌握發酵動態變化規律，進而更好地控制發酵條件，生產出更好的產品。高振鵬等[17]研究了益生菌發酵蘋果汁的動力學模型，建立了益生菌發酵蘋果汁和產生總酚的動力學模型，結果顯示，理論值和實驗值的平均誤差很小，說明模型很好地描述了益生菌發酵蘋果汁中總酚的變化。楊春敏[19]研究了蘋果渣多菌群發酵菌體生長模型、產物生成模型和基質消耗模型，建立的多菌群益生菌發酵動力學模型能夠準確預測發酵過程。

此外，由于益生菌發酵果蔬汁中含有活益生菌，果蔬汁中的活菌濃度、感官指標、酸度及代謝產物等指標是動態變化的，建立適合益生菌發酵果蔬汁的貨架期預測模型對于果蔬汁的銷售至關重要。李海萍[20]應用Arrhenius關系式建立的貨架期預測模型能夠準確預測益生菌發酵蜜柚飲料的貨架期，通過測定維生素C、微生物指標及感官評價變化，得出清汁型和渾濁型益生菌發酵蜜柚飲料的貨架期分別為22 和24 個月。影響發酵產品貨架期的主要因素是微生物，益生菌發酵果蔬制品中活菌數在貯藏及其銷售期間是否符合行業標準直接影響產品的貨架期。另外貯存溫度、酸度、包裝方式及材料也會影響果蔬產品的貨架期。Pimentel 等[21]報道了添加益生元低聚果糖和副干酪乳桿菌的澄清蘋果汁生產益生菌飲料，產品可接受性與純果汁相似，在冷藏條件下，益生菌飲料保質期可達28 d。采用玻璃瓶作為新飲料的包裝材料，能夠保持副干酪乳桿菌的活力。有研究發現新鮮火龍果汁中加入乳酸菌發酵火龍果汁，貨架期比鮮榨的火龍果汁延長了3 個月，而顏色和口感都未發生改變[22]，乳酸菌發酵降低了用于生產有機酸和次級代謝物的游離糖的含量，限制了果汁中腐敗微生物的生長[23]。

由于益生菌在不同種類果蔬制品中代謝活動不同，研究動力學過程中所選擇的模型也不相同，只有選擇合適的模型才能更好地描述發酵過程變化。益生菌發酵果蔬制品中含有活菌，其貨架期較短，并且在貨架期也一直在發生變化，從而影響果蔬制品的質量。保證益生菌發酵果蔬制品的品質及延長貨架期是科研人員一直不懈努力的方向。

1.5 香氣成分變化

果蔬中含有大量的風味物質，經過益生菌發酵后也會產生新的發酵風味。菌種種類、發酵時間、溫度、底物種類及濃度等都會影響益生菌發酵果蔬中風味物質的產生，這些風味物質主要有酸、醇、醛、酮、萜類等。由于益生菌種類、果蔬種類不同，經過發酵后會產生不同特征的香氣物質。這些變化如何發生、產生的機制如何，一直是研究者要探索的問題。

有學者采用GC-MS 測定了副干酪乳桿菌發酵功能性石榴飲料中的揮發性成分，結果顯示，貯藏時間、底物及發酵對香氣均有顯著的影響，特別是乙醇、2-癸酮和乙酸甲酯顯著增加，而己醇、2-乙基-1-己醇和壬醛等化合物減少，果汁中的酯類含量也有所增加[6]。Lu 等[7]開展了瑞士乳桿菌L10、副干酪乳桿菌L26 和鼠李糖乳桿菌HN001 對發酵楊桃汁風味的影響研究，研究得出不同益生菌菌株產生的揮發物變化較大，瑞士乳桿菌發酵楊桃汁對醛類及除苯甲酸甲酯外的所有內源酯降解效果顯著，能產生具有水果味和霉味的2-壬酮。瑞士乳桿菌和副干酪乳桿菌混菌發酵楊桃汁都會產生較多具有堅果味和杏仁香氣的醛類物質，而副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌則產生具有柑橘和花香味的芳樟醇。朱珺[24]等用一株植物乳桿菌發酵果蔬汁，結果顯示高酸性果汁如芒果汁和蘆薈汁在發酵后增加了酸爽風味，表明植物乳桿菌具有很強的耐酸性，而胡蘿卜汁、生姜汁、大蒜汁帶有生沖味，在發酵之后生沖味明顯減少且口感更加清新、醇香可口。

益生菌發酵果蔬制品中香氣成分產生機制復雜，不同菌種發酵果蔬制品產生的風味物質也不同。由于菌種發酵代謝產物的研究還不夠成熟，目前主要通過分析果蔬成分變化以及菌種代謝物質來確定發酵所產生的風味物質，因此，益生菌發酵果蔬制品中風味物質的研究還有一定的局限性。

1.6 制品功能評價

果蔬含有大量的營養物質。如何進一步提高果蔬中的這些功能物質含量是研究者亟待解決的問題之一。益生菌能將果蔬中的營養物質進行生物轉化，產生一些功效成分。科學證明人類食用了含有活菌的益生菌發酵果蔬制品后，能夠對人體產生功效，如抗氧化活性、防腐、降血糖、改善腸道菌群等。Li 等[25]利用植物乳桿菌發酵胡蘿卜汁，結果顯示發酵胡蘿卜汁中產生短鏈脂肪酸，能促進乳酸和雙歧桿菌的生長，從而降低血糖。另外，植物乳桿菌的代謝產物和胡蘿卜汁中的生物活性物質都具有調節血糖和胰島素、胰高血糖素、降血脂、減少氧化應激的功能。研究人員用植物乳桿菌發酵仙人掌梨汁喂養小鼠的研究表明，植物乳桿菌發酵仙人掌梨汁能夠使受檢病例的體重顯著下降，肥胖小鼠的脂肪指數降低[18]。Mazlan 等[26]研究發酵苦瓜汁得到α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，這與苷元和其他酚類化合物的含量和有效性較高有關。朱珺等[24]研究了一株具有益生特性的植物乳桿菌發酵果蔬汁，該果蔬汁能夠促進腸胃的蠕動，具有通便功能。

目前功能性食品越來越受到人們的歡迎。開展增加果蔬制品功能性研究，指導人們合理膳食是未來發展的方向。益生菌發酵果蔬制品功能評價是科研工作者研究的方向，既要分析鑒定發酵產生了哪些新的成分，還要疊加益生菌改善腸道菌群的功能，因此，功能評價的周期較長，只有經過嚴格評價后才能確定其功效。

1.7 產品中功能成分轉化

益生菌發酵果蔬制品中一些功能成分會發生轉化，特別是一些酚類物質之間的轉化[27]。果蔬中含有大量的酚類物質，具有抗氧化活性。酚類化合物大多數能夠到達結腸，在腸道微生物的作用下，酚類化合物會被轉化，產生代謝物，這些代謝物會被機體吸收，從而產生生理效應。由于機體腸道微生物的差異性，所產生的代謝物有所不同，產生的生理效應也會有差異[28-32]。

有研究發現，植物乳桿菌發酵蕓豆提取物，發酵后提取物中羥基肉桂酸的含量增加[33]，羥基肉桂酸是蔬菜中常見的多酚化合物之一，具有廣泛的生物活性，以糖基的形式廣泛存在于寡糖或多糖上，一些微生物產生的多糖水解酶能將與多糖或寡糖結合的肉桂酸從植物多糖中釋放出來，導致其含量增加[34]。Emmanuel 等[35]研究了乳酸菌發酵桑葚汁中酚類成分的變化情況，結果發現乳酸菌發酵可以使桑葚汁中的總酚、花青素、總黃酮含量均增加。總酚增加的原因是發酵使桑葚汁中更多的糖基化酚脫去糖基轉為為酚類化合物，黃酮醇增加的原因可能是復雜的多酚被乳酸水解酶分解成簡單的黃酮醇。Mantzourani等[36]研究了植物乳桿菌ATCC 14917 菌株生產功能性石榴汁，得出發酵石榴汁中的植物乳桿菌ATCC 14917 在儲存期間的高活性與發酵生成的酚類化合物有關。也有研究發現酚類化合物可以作為益生元[37]。

根據文獻資料，益生菌發酵果蔬制品中酚類化合物含量增加的主要原因是在益生菌作用下能夠使結合態多酚轉化成游離態酚類化合物，不同菌株產生的水解酶種類不同，轉化產生的酚類化合物也有所區別。

2 益生菌發酵果蔬汁存在的問題

2.1 活菌數難保持

由于益生菌發酵果蔬制品中含有活菌，產品品質在貨架期內一直在動態變化，保持益生菌發酵果蔬制品高活菌濃度是科研工作者努力的方向。目前，市面上出售的益生菌發酵果蔬汁活菌型產品的保質期較短，在貨架期由于貯藏溫度、時間、pH 以及菌種本身性質影響活菌，使其逐漸失活，活菌臨界濃度在食用時約為106～107CFU/mL[38]。此外，由于果蔬種類繁多，一些高酸果蔬產品無法提供最佳生長環境來確保益生菌活性，導致益生菌在發酵過程中失活。雖然益生菌發酵奶制品活菌數保持方面的研究較多，但是發酵果蔬汁中活菌數保持方面的研究幾乎是空白。目前通過一系列措施如細胞包埋或固定、添加益生元物質和微膠囊等能保持益生菌活性，但是這些技術大多有一定局限性，大面積推廣使用還需要進一步研究[39-41]。

2.2 風味問題

益生菌發酵果蔬汁過程中部分菌種會產生果香味，也會產生讓人不愉快的特殊風味[42]，且這些風味的生成比較復雜，許多風味至今沒有鑒定清楚。在益生菌發酵果蔬汁中，揮發性風味物質種類增加，其中醇、酯類物質增加明顯，有利于酯香型果汁果香和花香的突出（如蘋果汁和梨汁）；果蔬汁中氨基酸變化顯示出其與揮發性風味物質存在相互轉換的關聯性[43]。益生菌在食品飲料的感官、營養以及衛生品質中起著重要的作用，在發酵過程中會產生與菌種相關的芳香化合物來展現食品的風味[44]。益生菌發酵果蔬汁的特征風味物質不僅取決于風味物質的種類和含量，同時還與其風味特征、閾值相關，需通過嗅辨儀結合氣相色譜-質譜以及氣味活度值法綜合分析特征風味物質[45]。風味的產生與果蔬的品種、菌種的選擇都有一定的關系，要清楚風味的來源就應明確果蔬中的風味物質以及菌種在發酵過程中互相之間產生拮抗及其關聯的關系。另外，益生菌異味的產生還與貯藏時間、底物及發酵的菌種有關，機理比較復雜。由于在分子生物學方面的相關研究還不夠深入，這些問題一直沒有得到解決。

2.3 穩定性問題

復合果蔬汁在儲藏過程中會產生沉淀，影響果蔬汁的貨架期，從而降低商品價值，成為制約果蔬汁工業發展和提高果蔬汁品質的關鍵問題。關于果蔬汁后混濁原因的研究已有70 多年的歷史，早在20 世紀40 年代就有學者定性研究了蘋果汁混濁物，發現沉淀物中含有氮、硫、磷、鐵等元素[46]。在果蔬汁被益生菌發酵后，由于菌種與果汁的相互作用，沉淀產生的機制更加復雜。一些黏度較大的益生菌發酵果蔬漿在儲存的過程中黏度會逐漸增大，對果蔬漿品質影響很大[47]。目前，果蔬汁穩定性問題已經取得一定突破，發現在果蔬汁中主要懸浮固體為多糖和微生物。近幾年膜過濾技術被廣泛應用，但是成本相對較高，且還不成熟，僅能除去沉淀物質而將益生菌保留在果蔬汁中的技術未突破，還需要進一步努力。總之，果蔬汁穩定性方面仍有一些問題有待解決。

3 益生菌發酵果蔬制品未來的發展趨勢

益生菌發酵果蔬制品不僅保留了果蔬的營養物質，而且在發酵過程中發生生物轉化產生了代謝產物，賦予了產品特殊的發酵風味。益生菌發酵果蔬制品中的活菌能夠通過改善人體腸道環境來改善人體健康狀況，果蔬汁能為人體提供營養物質。雖然我國的益生菌發酵果蔬汁產業還處于起步階段，但是發酵果蔬汁的市場發展前景十分廣闊。結合益生菌發酵果蔬制品的發展方向以及現代科學技術發展，益生菌發酵果蔬制品未來的發展方向主要體現在以下方面：（1）性能穩定、高活性、后酸化可控的專用直投式果蔬益生菌菌劑的制備及開發；（2）功能性益生菌的篩選以及功能性益生菌發酵果蔬制品的開發，如降脂、降糖、降壓、抗衰老、抗氧化等益生菌發酵果蔬制品的研制；（3）針對益生菌發酵果蔬制品中果汁褐變、活菌存活時間短、產品穩定性較差等問題展開的活菌濃度保持技術、穩定性及防褐變技術研究；（4）益生菌發酵果蔬制品會產生復雜的香氣物質，研究發酵過程中果蔬營養物質及菌種互相作用關系，明晰香氣物質產生的機制；（5）益生菌發酵果蔬制品過程中，進一步明晰多酚、蛋白質、多糖等營養成分經過生物轉化后的代謝產物種類、益生菌產生的酶種類以及轉化機理研究；（6）高產功能性代謝產物的益生菌的篩選及新型發酵果蔬制品的開發，例如高γ-氨基丁酸的益生菌發酵果汁、高輔酶Q10的益生菌發酵果汁等。