熒光PCR檢測技術對非洲豬瘟的常規監測

馬成立

（遼寧省葫蘆島市建昌縣動物疫病預防控制中心 125300）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性，高度接觸性的傳染病。發病率和死亡率可達100%。世界衛生組織將其列為法定報告的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。該病雖然不是人畜共患病，無公共健康危害，但由于目前無有效的疫苗和治療方法，任其流行會給養豬業帶來巨大的經濟損失，造成嚴重的社會影響，沖擊畜產品國際貿易。我國是世界第一養豬大國，飼養量占世界總量的50%左右，切實做好非洲豬瘟病毒防控工作事關我國養豬業持續健康發展。

利用實時熒光PCR 定性檢測是否存在非洲豬瘟病毒，對早期監測，防控非洲豬瘟具有重要的指導意義。

在實際工作中，我們首先選擇洛陽萊普生信息科技有限公司生產的核酸提取試劑盒和核酸檢測試劑盒來進行非洲豬瘟病毒檢測實驗，效果非常好。

在實驗過程中，我們需要準備的儀器設備有數顯恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機、生物安全柜、移液器等，還需自備無水乙醇。

被檢樣品是動物組織，應保存于50%甘油生理鹽水中，然后取樣約1g，用手術剪剪碎，于研缽中加入生理鹽水繼續研磨，混勻，后轉移至1.5ml 的滅菌離心管中，離心待用。如果是血液或全血樣品，則使用離心機離心析出血清后置于1.5ml滅菌離心管中待用。環境樣品則保存于病毒收集管中，離心后取上清液置于1.5ml 滅菌離心管中待用。

無論何種樣品，實驗開始前都要在數顯恒溫水浴鍋中進行60℃的病毒滅活。

實驗開始時首先要提取樣品核酸。采用柱狀提取法，因采用的離心吸附柱可以特異性的結合核糖核酸或脫氧核糖核酸，加之獨特的緩沖液A，緩沖液B，緩沖液C，提取的核酸純度高，質量穩定可靠。在試劑盒配備的緩沖液C 瓶中一定要先加入4 倍體積的無水乙醇，混勻后做好標記，備用。

1 核酸提取

（1）取已處理好的待檢樣品，在已開機的生物安全柜中吸取200μl 上清液加入1.5ml 的相對應的滅菌離心管中，做好標記，然后分別加入600μl 的緩沖液A，溫和的上下顛倒混勻6～8 次，室溫靜置5min；2～8℃下用高速冷凍離心機5000r 離心1～2min，用移液器取400μl 的上清液轉入新的滅菌離心管中。

（2）加入200μl 的無水乙醇，立即上下顛倒混勻，全部轉入已做好對應標記的吸附柱中，靜止2min，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（3）向吸附柱中加入500μl 的緩沖液B，室溫下靜止2min，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（4）向吸附柱中加入700μl 的緩沖液C，2～8℃下12000r 離心30～60s，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

（5）2～8℃下12000r 離心2min，去除吸附柱中殘留的液體。

（6）將吸附柱置于對應的干凈的滅菌離心管中，開蓋晾干3～5min，向吸附膜的中間部位懸空滴加60μl 的洗脫液，室溫放置2min。

（7）室溫下12000r 離心1min，離心管中的液體即為提取的核酸。-20℃保存或直接進行下一步實驗。

注意事項：實驗前應準備好盛有消毒液的容器，以便放置實驗過程中的垃圾，實驗人員必須經過專業培訓才可上崗，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區各階段用品不得交叉使用，各區間人員流動及空氣流向應有嚴格要求。

2 核酸檢測

該檢測試劑盒檢測原理是針對非洲豬瘟病毒高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含有非洲豬瘟病毒基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR 過程中相應通道的熒光信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。該試劑盒主要組成成分有：擴增反應液1 管，陰性對照1 管，陽性對照1 管，說明書1 份。

實驗前20min 將試劑盒從-20℃的冰柜中取出，以平衡至室溫25℃，并使試劑完全溶解。

（1）按照需要檢測的樣本數加上陰性對照數和陽性對照數，取出PCR 反應管，按每管17.5μl 的用量分裝到PCR 反應管中。

（2）加入待檢樣本提取的核酸，每管加入2.5μl，陰性對照和陽性對照管也加入2.5μl，記錄加樣順序。

（3）蓋好PCR 反應管蓋，將PCR 反應液與樣本核酸震蕩混勻后2000r 離心10s。以上實驗步驟均在核酸提取室進行。

（4）將PCR 反應管轉移到核酸擴增區，準備上機進行核酸擴增。

（5）開機預熱并檢驗儀器性能。

（6）取準備好的PCR 反應管，放置在儀器樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（7）按照樣品槽上樣品位置，在儀器上進行樣品布局。

（8）設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR 擴增：反應體系設為20μl，95℃30s，一個循環；95℃5s，60℃40s，40 個循環。在FAM 通道采集熒光信號，ABI 系列熒光定量PCR 儀不選ROX 校正，淬滅基團選None，然后進行核酸擴增。

3 結果分析

（1）結果分析條件設定：閾值設定原則是合理調整閾值線，不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整。

（2）試劑盒中的陽性對照Ct 值小于或等于30，有明顯指數增長，呈典型的“S” 形曲線。陰性對照Ct 值大于38 或無Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無明顯指數增長期和平臺期，則該試劑盒具有有效性。

（3）實驗結果：如果樣品檢測結果Ct 值小于或等于35，有明顯指數增長，表明該樣品中檢測出該病毒。如果樣品檢測結果Ct 值在35～38 范圍，為可疑，此時應對樣品進行重復檢測，如果重檢結果Ct 值仍在35～38 之間，有明顯指數增長，則判定該樣品是陽性，否則為陰性。如果被檢樣品檢測結果Ct 值大于38 或無Ct 值，表明該樣品中沒有檢測出該病毒，為陰性，結果分析后要保存當前的分析結果，記錄好閾值。

4 注意事項

實驗室管理應嚴格按照國家有關臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。實驗前仔細閱讀試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟進行，避免導致錯誤結果。實驗過程要分區進行，分別在試劑準備室，核酸提取室，擴增反應室進行。實驗操作的每個階段使用的儀器和設備必須專用，不得交叉使用。所有試劑均應在規定的溫度儲存，冷凍保存的各試劑使用前應完全融化，8000r 離心15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器槍頭盡量在液體表面層吸取，使用后立即放回冰柜，冷凍保存。使用不含熒光物質的一次性手套，實驗過程中經常替換手套，預防交叉污染。操作過程中吸取液體，設定時間等全部過程必須精確。為防止熒光干擾，不要在PCR 反應管上做任何標記，并避免用手直接接觸。實驗過程中產生的廢棄物及試劑盒內試劑組分在實驗中均按照具有潛在傳染性物質處理方法進行處理。操作臺面，離心機，生物安全柜，移液器等儀器用品在實驗結束后必須用消毒液進行擦拭消毒或浸泡消毒，實驗房間在實驗結束后用紫外線燈進行消毒處理。被檢樣品在采集、儲存、運輸及核酸提取過程中操作方法不當，容易造成核酸降解而產生假陰性結果，當被檢樣品核酸濃度過低時也可能產生假陰性結果。被檢樣品在采集和制備過程中如果發生交叉污染，容易產生假陽性結果。