息痛散對高尿酸血癥并發急性痛風性關節炎大鼠治療作用研究*

李娟娥，姜小帆，南曉強，劉沈楠，吉海旺，雷 鵬△

1.陜西省人民醫院(西安710068)；2.陜西中醫藥大學(咸陽712046)

高尿酸血癥(Hyperuricemia，HUA)與痛風(Gout)是嘌呤代謝障礙引起的代謝性疾病，痛風除高尿酸血癥外，還可表現為急性關節炎(Acute gouty arthritis，AGA)，其主要表現為關節及周圍軟組織的紅、腫、熱、痛，病情嚴重者出現關節破壞。隨著我國經濟的發展和人民生活方式的改變，高尿酸血癥和痛風的發病率逐年上升。祖國醫學經過數千年的發展歷程,對痛風的防治形成了較為完整的理論體系和豐富的臨床經驗，但缺乏廣泛深入的相關機制研究和高證據的臨床研究。我們的前期實驗研究和臨床應用均發現息痛散具有降低血清尿酸和緩解急性痛風性關節炎癥狀的作用[1-2]，主要與降低炎性因子有關，但對降低血尿酸及篩選炎癥信號通路的靶點研究尚待進一步明確。本研究通過關節腔注射尿酸鈉晶體及腹腔注射氧嗪酸鉀溶液建立HUA+AGA大鼠模型，觀察息痛散對急性痛風性關節炎大鼠的治療作用，并探討其可能的作用機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：清潔級Wistar雄性大鼠60只，12周齡，平均體重(250±20)g。3只大鼠為一籠飼養。飼養溫度(23±2)℃,濕度(55±10)%,每日12 h光照維持,晝夜循環。各組大鼠均常規飼養，并自由攝水、進食。動物由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物與試劑：氧嗪酸鉀(批號：2207-75-2)、尿酸鈉(批號：U2875-5G)、秋水仙堿(批號：H20113208)。Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)抗體(批號：ab74279、ab175315、ab16502)。ELISA試劑盒、TGF-β1(型號：HLE20746)、IL-1β(型號：HLE20024)、IL-10(型號：HLE20095)、Histamin(型號：HLE20597)。息痛散顆粒(由三九藥業提供中藥免煎顆粒)。

1.3 實驗儀器：酶標儀multiskan mk3型(Labsystems dragon公司)、高速冷凍離心機TGL-16、湘儀DYY-7C型電泳儀、恒溫培養箱DHP-9052型。

2 實驗方法

2.1 動物分組：將60只Wistar大鼠按體重分層，采用Excel隨機方法將大鼠分出12只為正常組，其余均復制模型。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組、息痛散低劑量組、息痛散高劑量組，每組12只。所有大鼠均分籠飼養，每籠6只，自由攝食、飲水，并定期清潔、消毒。

2.2 藥物配制方法：將3 g氧嗪酸鉀晶體溶于97 ml生理鹽水中配成3%氧嗪酸鉀溶液；1250 mg尿酸鈉結晶加45 ml生理鹽水中，再加5 ml吐溫80，配成25 mg/ml的尿酸鈉溶液50 ml，0.22 μm密理博除菌濾器過濾除菌。

2.3 模型建立：按1 ml/100 g的劑量將3%的氧嗪酸鉀進行大鼠腹腔注射，2次/d，連續注射7 d，構建HUA模型。第4天采用2%的戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，從右側踝關節背側按30°～45°方向插入脛骨肌腱內側，將0.2 ml的尿酸鈉溶液注射入關節腔內，誘導AGA模型，如關節有明顯腫脹，即表明模型復制成功[3-4]。

2.4 給藥方法：給藥劑量根據“人與動物體表面積換算的等效劑量” 進行換算[5]，秋水仙堿組、息痛散高劑量組和息痛散低劑量組的用藥劑量分別為0.3 mg/(kg·d)、72 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)，正常組及模型組給予等體積生理鹽水。構建AGA模型24 h后給藥， 2次/d，連用10 d均為灌胃治療。

2.5 大鼠足跖腫脹度的測定：以上各組于治療前、治療后4、12、24、48 h測定各組鼠足容積[5]。足跖腫脹率=(給藥后足容積-給藥前足容積)/給藥前足容積×100%。

2.6 標本留取：治療第5天各組均取6只大鼠，末次給藥2 h后，按0.3 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液，大鼠麻醉后，腹主動脈取血，4000 r/min，離心10 min，分離血清，檢測血清尿酸及血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量。取右踝關節，留拍關節大體圖片、關節腔內圖片、關節面圖片。關節組織獲取后取一部分放置于4%多聚甲醛溶液固定后行HE染色；另一部分將滑膜組織切成小塊放于EP管，迅速投入液氮中，用于Western blot檢測。剩余每組6只大鼠于治療10 d后，同上處理。

2.7 Western blot檢測:取一定量凍存滑膜組織，加入400 μl PMSF的RIPA蛋白裂解液于冰上勻漿制備樣品，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白；PVDF膜轉膜約90 min。用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1 h。一抗孵育：將封閉液按照1∶500稀釋；二抗孵育：用封閉液按照1∶3000稀釋HRP標記二抗,孵育2 h。用ECL試劑盒反應,X光片壓片、顯影、定影,并用Lab Works軟件對圖像進行灰度分析。

2.8 大鼠踝關節滑膜組織的病理形態學變化:用4%多聚甲醛溶液固定滑膜組織，分別進行脫鈣和脫水后石蠟包埋，切片后行HE染色，于顯微鏡下觀察大鼠踝關節滑膜組織的病理形態學變化。

結 果

1 各組大鼠足跖腫脹率比較 給藥后4 h，各組足跖腫脹率均升高，與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。秋水仙堿組足跖腫脹率減輕，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，息痛散低劑量與高劑量組均有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。給藥后12 h，各組足跖腫脹率升高，與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，秋水仙堿組和息痛散高劑量組足跖腫脹率均減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后24 h，各組足跖腫脹率均高，與正常組比較，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組足跖腫脹率減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。給藥后48 h，與正常組比較，各組關節腫脹度均高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，各治療組足跖腫脹率均低，差異有統計學意義(P<0.05)。綜上說明，各給藥組均可減輕HUA+AGA大鼠模型的關節腫脹度，秋水仙堿約從4 h開始起效，息痛散組約12 h開始起效。見表1。

表1 各組大鼠足跖腫脹率比較(%)

2 各組大鼠血尿酸水平比較 治療5 d后，與正常組UA(98.20±15.20)μmol/L比較，模型組尿酸(Uric acid,UA)(287.56±35.23)μmol/L、秋水仙堿組UA(265.37±31.02)μmol/L、息痛散低劑量組UA(258.87±36.42)μmol/L、息痛散高劑量組UA(248.12±25.87)μmol/L均高，差異有統計學意義(P<0.01)。說明采用腹腔注射氧嗪酸鉀方法可以成功構建HUA模型。各藥物治療組中血清UA與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

3 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量比較 與正常組相比，模型組和各藥物治療組大鼠血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量均有差異，具有統計學意義(P<0.01)。治療5 d和10 d時秋水仙堿組血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。治療5 d時息痛散高劑量組與模型組比較，各項指標均有統計學差異(P<0.05)，而息痛散低劑量組的IL-1β、Histamin含量與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。治療10 d時，息痛散低劑量組IL-1β、IL-10與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平比較(ng/ml)

4 各組大鼠滑膜組織內Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)表達比較 通過Western blot檢測，治療5 d后各藥物治療組大鼠滑膜組織內Caspase-1、TNF-α、NF-κB(p65)含量與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。治療10 d后，秋水仙堿組和息痛散高劑量組Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表達與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，而息痛散低劑量組，各指標差異，無統計學意義(P>0.05)。見表3(圖1)。

表3 各組大鼠滑膜組織內Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表達比較

A：模型組；B：息痛散低劑量組；C：息痛散高劑量組；D：秋水仙堿組

5 各組大鼠關節滑膜組織病理形態學情況 通過HE染色觀察到，治療10 d時模型組大鼠滑膜組織即出現炎性病變，關節腔積液顯著增多，滑膜組織充血、水腫，可見大量的淋巴和單核細胞浸潤，關節軟骨表面光滑，未見明顯顆粒；與模型組相較，秋水仙堿組及息痛散高劑量組關節腔積液明顯減少，滑膜組織輕度充血、水腫，可見少許炎性細胞浸潤；息痛散低劑量組與模型組比較，區分度不顯著(圖2)。

A：模型組；B：秋水仙堿組；C：息痛散低劑量組；D：息痛散高劑量組

討 論

痛風是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高導致單鈉尿酸鹽沉積于骨關節，引發的急、慢性炎癥和組織損傷[6]。目前，研究認為急性痛風性關節炎主要與TLR4/NF-κB的炎性信號通路有關。NF-κB是一種DNA結合蛋白因子，參與不同促炎分子和不同酶的轉錄，如細胞因子、趨化因子、細胞黏附等。當MSU沉積于細胞外時，與細胞膜上的Toll樣受體結合，活化NF-κB，進一步激活NLRP3炎癥小體，誘導pro-Caspase-1自我剪切為活化的Caspase-1，進而活化IL-1β、IL-18，激活下游的一系列炎癥反應[7-8]。IL-10是一種抑制軟骨分解的細胞因子[9]，可直接抑制破壞軟骨的IL-1和TNF-α等炎性因子的合成。

中醫學將本病納入“骨痹、痹證、筋痹、歷節風、白虎歷節”等范疇，主要因先天脾腎不足，或七情損傷、或飲食不當、或關節外傷，致痰濁內聚，或加之外感邪氣，形成熱毒、痰濁、瘀血滯留肢體筋脈關節，形成紅、腫；焮熱及劇痛[10-11]。息痛散由石膏、忍冬藤、黃柏、蒼術、牛膝、桃仁、全蝎等組成。方中生石膏，辛甘性寒，清透肌膚骨節郁熱；忍冬藤清熱解毒、宣泄風熱，兩藥共為君藥；蒼術燥濕健脾，黃柏清熱燥濕，合為臣藥；桃仁、全蝎活血化瘀、通絡止痛；川牛膝祛風除濕、疏經通絡，且引藥下行，使諸藥直達病所。全方共奏清熱瀉火、祛瘀通絡、燥濕化痰之功。

近年來，中藥復方治療AGA研究比較多，證實清熱祛濕、通絡止痛的中藥復方具有消炎止痛的作用，可以改善患者的關節疼痛等癥狀[12]，但目前大部分研究僅停留在藥效學方面，缺乏深入的機制研究[13-14]。本研究發現息痛散可以減輕HUA+AGA大鼠模型關節腫脹度，改善滑膜組織的炎性反應，調節血清中TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin水平，降低踝關節滑膜組織中Caspase-1、TNF-α、NF-κB蛋白的表達，其作用機制可能與TLR4/NF-κB信號通路抑制NLRP3炎性體激活有關。高尿酸血癥是導致AGA的主要因素，故本研究采用的是高尿酸血癥+急性痛風性關節炎模型，更符合人類急性痛風性關節炎的發病機制，但可能由于采用的是急性炎癥期模型，故對關節軟骨暫未形成明顯破壞，需要日后進一步完善。