基于HS-SPME-GC-MS對(duì)云南地區(qū)雷公藤有毒蜜的分析

趙琴 莫湘桂 譚墾

（1 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園；2 中國科學(xué)院大學(xué)）

當(dāng)蜜源植物花期結(jié)束或者氣候干旱導(dǎo)致植物蜜露分泌下降，蜜蜂會(huì)采集有毒蜜源植物花蜜或蜜露，生成含有植物源毒素的蜂蜜[1-3]。云南地區(qū)生物多樣性豐富，植被覆蓋率高，蜂群可以采集的蜜粉源植物種類豐富。根據(jù)文獻(xiàn)記載，云南地區(qū)有毒蜜粉源植物主要有毛茛科、罌粟科、山茶科、瑞香科、衛(wèi)矛科、藍(lán)果樹科、杜鵑花科、馬錢科、茄科、馬桑科、石蒜科和菊科等植物[4]。迄今，僅少數(shù)文獻(xiàn)對(duì)我國有毒蜜源植物種類、分布、花、花期及毒性等進(jìn)行系統(tǒng)整理歸納[4,5]，為蜜蜂放養(yǎng)場(chǎng)地選擇及采取適宜預(yù)防措施提供指導(dǎo)，并為蜂蜜食用安全及中毒原因追溯提供科學(xué)參考。盡管蜂農(nóng)對(duì)有毒蜜花期的了解可以規(guī)避掉部分有毒蜜的產(chǎn)生，但更多情況下蜂農(nóng)主要關(guān)注蜂群放置地點(diǎn)的主要蜜源，所以造成每年都會(huì)有有毒蜜流入市場(chǎng)，對(duì)消費(fèi)者的身體安全造成威脅。近些年，由于人們盲目追求野生蜂蜜，食用未經(jīng)過安全檢測(cè)的蜂蜜，尤其在有毒蜜源山區(qū)，誤食有毒蜂蜜而中毒的事件時(shí)有發(fā)生，對(duì)有毒蜜的研究已經(jīng)成為關(guān)系蜂蜜市場(chǎng)安全的一個(gè)重要研究內(nèi)容。

國內(nèi)對(duì)于有毒蜜研究的相關(guān)文獻(xiàn)主要集中在有毒蜜源植物的種類、分布以及有毒植物的花粉鑒別[4-9]，也有部分國內(nèi)外學(xué)者對(duì)有毒蜜源植物的生物堿進(jìn)行了一定研究。國外關(guān)于有毒蜜的研究也主要集中于基于液相色譜法檢測(cè)有毒蜜中不同的有毒生物堿以作為對(duì)有毒蜜的生物標(biāo)記。例如，陳順安[10]采用高效液相色譜（HPLC）方法，對(duì)昆明山海棠蜜的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)昆明山海棠蜜中存在雷公藤甲素；趙玲玲[11]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS/MS）的方法，對(duì)博落回蜂蜜中的異喹啉類生物堿的定性和定量分析，測(cè)得博落回蜂蜜中主要存在4種異喹啉生物堿。

然而，上述方法所采用的液相色譜法雖然都能對(duì)有毒蜜進(jìn)行確定，但實(shí)驗(yàn)的前處理過于復(fù)雜，過程繁瑣，耗時(shí)長，使得其效率不能滿足快速經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)需求。因此，本研究選擇采用固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法HS-SPME-GC-MS，希望可以實(shí)現(xiàn)對(duì)有毒蜜的快速鑒定，為蜂蜜市場(chǎng)的安全檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

7890A-5975C氣象色譜質(zhì)譜聯(lián)用，美國Agilent公司；HP-INNOWAX（60m×0.25mm×0.25μm df）色譜柱，美國Agilent 公司；65μmPDMS/DVB萃取頭，美國Supelco公司；LE303E/02電子天平，德國Mettler Toledo公司；Milli-Q Integral 15超純水儀，德國Merck Millipore DE公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒公司；Vortex3000振蕩器，德國Wiggens公司；15ml頂空萃取瓶，安徽賽普瑞斯玻璃機(jī)械有限公司。

1.2 樣品及試劑信息

蜂蜜樣本全部取自云南地區(qū)，包括石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、棗花蜜、油菜蜜、咖啡蜜、疑似雷公藤的有毒蜜（姚安縣、哀牢山保護(hù)區(qū)）等，且于該花花期在當(dāng)?shù)仞B(yǎng)蜂場(chǎng)直接采集，并將采集的樣品在8℃下避光保存。

對(duì)甲酚，分析標(biāo)品，上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

頂空直接進(jìn)樣法：準(zhǔn)確稱取2.5g蜂蜜，按照5:1的比例加入0.5ml超純水放置于15ml頂空瓶中，然后用PTFE/硅膠隔膜緊緊地蓋住瓶口，旋緊瓶蓋密封待測(cè)。樣品提取前在60℃加熱10min，用混勻器混勻。

頂空固相微萃取法：將65μmPDMS/DVB萃取頭在250℃條件下老化半小時(shí)。將經(jīng)老化處理后的萃取頭插入裝有2.5g蜂蜜的頂空瓶，快速推出萃取纖維頭，置于60℃水浴中恒溫60min，使纖維頭充分吸附蜂蜜的揮發(fā)性成分，進(jìn)樣時(shí)，在250℃條件下解吸，同時(shí)啟動(dòng)數(shù)據(jù)采集，2min后拔出萃取頭。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)條件

圖1 對(duì)甲酚標(biāo)品及8種蜂蜜中對(duì)甲酚色譜圖

表1 哀牢山和姚安的7種有毒蜜揮發(fā)性成分匯總

固相微萃取條件：萃取溫度60℃，萃取時(shí)間60min；拔針時(shí)間2min；操作模式：恒定。色譜條件：進(jìn)樣口溫度：250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2min，升溫速率5℃/min至220℃，升溫速率10℃/min 至250℃，保持11min；分流進(jìn)樣，載氣：氦氣（99.99%），恒流流速1.0ml/min，分流比5:1。質(zhì)譜條件：電離方式電子轟擊電離（EI+）；電子能量：70eV；離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式：全掃模式，掃描范圍35～550m/z；溶劑延遲0min。

1.3.3 定性與定量分析

采用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST 08譜庫）對(duì)揮發(fā)及半揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性和半定量分析。

2 雷公藤有毒蜜的GC-MS分析

本研究按照1.3.2的條件對(duì)哀牢山和大姚的7種有毒蜜樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，通過對(duì)NIST8.0圖譜庫檢索、圖譜解析，最終在2個(gè)哀牢山和5個(gè)姚安樣品中解析出133個(gè)成分。通過對(duì)雷公藤有毒蜂蜜化學(xué)指紋圖譜疊加圖比對(duì)研究得知這7種有毒蜂蜜的共有成分為異戊醇、2-庚醇、壬醛、順-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、反-A,A-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇、冰醋酸、2-乙基己醇、苯甲醛、異佛爾酮、優(yōu)葛縷酮、己酸、苯乙醇、辛酸、對(duì)甲酚、壬酸、正癸酸、棕櫚酸這17種成分。

在表1中將有毒蜜中的揮發(fā)物種類歸為醇、醛、酚、烷烴、酸、酯、醚、酮以及其他成分9類。結(jié)合相對(duì)面積可以得到在姚安采集的有毒蜜：姚安1、姚安2、姚安3中含量較多的揮發(fā)性成分是酸類、酯類和酮類；姚安4和姚安5中醇類、酸類、酯類和酮類的含量比較多；在哀牢山1和哀牢山2中醇類、酸類和酮類的含量比較多。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果得知，在有毒蜜中醇類、酸類、酯類、酮類的化合物種類比較豐富。

通過對(duì)雷公藤有毒蜜中揮發(fā)性成分的分析發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的7種有毒蜜中都存在對(duì)甲酚，對(duì)甲酚是一種高毒物質(zhì)，口服-大鼠LD50為207mg/kg。對(duì)化合物進(jìn)行定性確認(rèn)，分析結(jié)果顯示：對(duì)甲酚標(biāo)品保留時(shí)間為34.147min，定性離子107/77；在有毒蜜中的保留時(shí)間約為34.14min，在該出峰位置均發(fā)現(xiàn)定性離子（107/77），說明雷公藤有毒蜜中均存在化合物對(duì)甲酚。結(jié)合對(duì)云南地區(qū)石榴蜜、枇杷蜜、苕子蜜、棗花蜜、油菜蜜、咖啡蜜7種常見蜜源的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，這種化合物僅在棗花蜜中出現(xiàn)過且相對(duì)含量比較少。實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)甲酚標(biāo)品對(duì)有毒蜜及棗花蜜中的對(duì)甲酚色譜圖疊加，得到了圖1。通過峰面積和濃度比值得到這8種蜂蜜中對(duì)甲酚的含量，其中有毒蜜中對(duì)甲酚的含量在0.005mg/kg～0.11mg/kg，棗花蜜中對(duì)甲酚的含量相對(duì)較少為0.02mg/kg，根據(jù)此檢測(cè)結(jié)果可以將對(duì)甲酚作為鑒別有毒蜜的一個(gè)依據(jù)。此外，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)在有毒蜜中含有多種有毒成分，其中在哀牢山有毒蜜中檢測(cè)到異喹啉也屬于高毒物質(zhì)，口服-大鼠LD50為331mg/kg。雖然目前檢測(cè)結(jié)果顯示這些成分含量都不是很高，但是如果經(jīng)常性的食用含有此類物質(zhì)的有毒蜜同樣會(huì)對(duì)健康造成危害。

3 結(jié)果與討論

本研究發(fā)現(xiàn)哀牢山和姚安有毒蜜中的揮發(fā)性成分存在較大差異，很可能是因?yàn)檫@些蜂蜜是中華蜜蜂采集自不同花型造成，在雷公藤植物周圍存在一些其他花，不同采集地點(diǎn)周圍分布的植物存在差異造成這些蜂蜜在揮發(fā)性成分上的差異。但是研究結(jié)果表明這7種有毒蜜中都存在較高含量的對(duì)甲酚，而且與云南地區(qū)7種常見單花蜜對(duì)比，僅棗花蜜中存在該成分，并且低于有毒蜜，所以認(rèn)為對(duì)甲酚可以作為有毒蜜的一個(gè)標(biāo)志性化合物。