外泌體在肝癌中的應用研究

蔣佳紅，李 游，鄧知敏，石媛媛，盧丹陽，楊 嵐，宋煒熙，胡 琦

（湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208）

原發性肝癌是肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤，有“癌中之王”的稱號，發病率居我國惡性腫瘤第5 位，是我國第4 大癌癥死亡原因。盡管目前肝癌治療手段可有效治療早期肝癌，但由于肝癌發現晚、發展快，患者確診時往往已到中晚期，臨床僅30%～40%的患者能夠在早期獲得有效治療。外泌體是一種直徑40～150 nm 的胞外囊泡，含有蛋白質、脂質和RNA 等生物活性物質，其所含成分與來源細胞密切相關。近年來，許多研究證明外泌體在肝癌的發生發展進程中起關鍵作用，外泌體在肝癌診斷與治療中具有重要的臨床應用潛力。從外泌體入手，或可更加清晰的闡明肝癌發生發展的機制。本文將從外泌體參與肝癌發生發展的機制、用于肝癌診斷的可行性以及在中、西醫治療肝癌中的潛力三方面進行總結，以期為進一步研究及應用外泌體診治肝癌提供參考。

1 外泌體與肝癌發生發展相關機制

1.1 外泌體與肝癌新血管形成 肝癌生長快、易轉移，屬于強血管依賴性腫瘤，已有研究證實肝癌細胞源性外泌體參與新生血管形成。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）通過誘導自噬或直接形成重塑血流的微管結構對抗瘤內缺氧，并且腫瘤微環境中存在可以促進其生長的生長因子，在外泌體的作用下形成正反饋，導致不良預后。具有CSC 性質的CD90+肝癌細胞來源外泌體可傳遞來源細胞的lncRNA-H19，介導內皮細胞轉化為促血管生成表型，并提升細胞間粘附功能[1]。抗血管生成療法治療后繼發性的腫瘤血管形成和腫瘤生長嚴重限制了臨床肝癌治療效果。曾燁等[2]針對這一情況進行了模擬肝癌實驗研究，發現外泌體在此過程中發揮了重要作用。血管生成抑制劑在抑制血管形成、促進人臍靜脈內皮細胞自噬的同時，還誘導富血管生成因子外泌體釋放，這些外泌體顯著促進了內皮血管生成和肝癌血管生成。

1.2 外泌體與免疫反應 免疫抑制是腫瘤侵襲和轉移的重要因素，腫瘤細胞源性外泌體通過傳遞腫瘤抗原和介導腫瘤免疫逃逸的相關蛋白成分，誘導T淋巴細胞凋亡、耗竭，實現腫瘤免疫逃逸。尹春來[3]發現肝癌細胞源性外泌體內有大量miRNA146a-5p，能夠介導巨噬細胞向M2 型極化，導致T 淋巴細胞耗竭而加快肝癌進程。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是人體重要的抗原提呈細胞，DC 通過活化初始T 淋巴細胞，啟動人類抗腫瘤特異性免疫應答，CD80 是提供T 淋巴細胞活化“第二信號”的重要分子。HepG2 肝癌細胞外泌體可降低DC 表面CD80分子的表達，并且DC 的成熟標記分子CD83 也呈低表達[4]。提示肝癌細胞外泌體可能通過誘導全身性免疫功能下降而實現腫瘤的發展和轉移。肝癌細胞來源外泌體可通過多種途徑作用于調節腫瘤免疫的共刺激分子，實現腫瘤免疫逃逸。程序性死亡配體-1（PD-L1）能夠與表達在T 細胞表面的程序性死亡受體-1（PD-1）結合，抑制T 細胞增殖以及細胞因子分泌，負調控淋巴細胞的激活。肝癌細胞源性外泌體可與PD-1 靶向結合，PD-L1 表達上調，引起T 淋巴細胞凋亡，并抑制巨噬細胞活性，實現免疫逃逸[5]。另外，腫瘤遞送的外泌體可通過STAT3 信號通路增加巨噬細胞中PD-L1 的表達和細胞因子的分泌，從而引起免疫抑制狀態[6]。

1.3 外泌體與腫瘤微環境 腫瘤細胞與周圍細胞的交流對惡性腫瘤的發生、發展起到重要作用，外泌體通過傳遞肝癌相關物質信息，調節周圍細胞，改變腫瘤微環境，為肝癌細胞的生長轉移創造有利環境。肝癌細胞來源外泌體通過傳遞miRNA-103 至內皮細胞，降低血管P120 連環蛋白、內皮型鈣黏素以及閉鎖小帶的表達，削弱內皮連接的完整性，進而提高血管通透性并促進肝癌細胞轉移[7]。癌癥相關的成纖維細胞在調節腫瘤進展中起關鍵作用，外泌體是肝癌細胞與成纖維細胞交流的信使。已有研究表明，miR-320a-PBX3 途徑通過抑制MAPK 途徑的激活起到抑制腫瘤進展的作用。Li X 等[5]發現肝癌患者癌組織中成纖維細胞源性外泌體中的miRNA-320 a 表達較正常下降，與其直接下游靶標PBX3 結合減少，阻礙MAPK 信號轉導通路的作用減弱，影響細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和MMP2 的表達，從而促進細胞增殖和轉移。此外，Fang T 等[8]發現肝癌細胞來源的富miRNA-1247-3 p 外泌體靶向作用于B4 GALT3，促進成纖維細胞激活并分泌IL-6 和IL-8 等促炎細胞因子，促進癌癥的進展，甚至介導肝癌肺轉移。

1.4 外泌體與肝癌耐藥 細胞耐藥性的出現降低了化療效果，這已成為肝癌化學治療中的難題。耐藥的發生由多種機制共同參與，目前研究表明，外泌體在耐藥細胞和敏感細胞之間的信號傳遞中發揮了關鍵作用。Fu X 等[9]以多藥耐藥細胞株和敏感細胞系為研究對象，發現耐藥細胞通過外泌體將miRNA-32-5p 遞送至敏感細胞，抑制PTEN 進而激活胞內磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 途徑，并且通過調節血管生成和上皮間質轉化，誘導肝癌敏感細胞發生多藥耐藥。轉化生成因子-β（TGF-β）可降低肝癌細胞對索拉非尼和阿霉素的敏感性，Takahashi K[10]發現TGF-β 在降低敏感性的同時，使lncRNAROR（長鏈非編碼RNA)高度表達于肝癌細胞，肝癌細胞外泌體進而攜帶lncRNA-ROR 至周圍細胞，擴大耐藥細胞范圍。

2 外泌體與肝癌的診斷、預后

目前，肝癌的主要診斷方法為影像學檢查、血清分子標志物檢測以及病理組織檢查，影像學檢查及血清分子標志物無法對肝癌早期診斷和微小病灶做出明確診斷；病理組織檢查雖能明確診斷，但其成功率受病灶大小、穿刺進針路徑等因素影響，且臨床上有出血、疼痛等并發癥，肝癌早期診斷仍是臨床上面臨的一大問題。

近年來，外泌體用于腫瘤生物標志物早期診斷已成為一大研究熱點。屈振等[11]通過提取30 例肝癌患者和10 例健康體檢者血清外泌體，分析發現肝癌患者外泌體miRNA-665 表達顯著上升，且miRNA-665 表達程度越高，患者的臨床情況越不良。盡管血清miRNA 表達水平的變化也可提示肝癌的發生，但檢測靈敏度遠低于血清外泌體包含的miRNA[12]。另外，外泌體檢測可為評估肝癌侵襲、轉移狀況提供幫助。肝癌患者血清外泌體miRNA-638 表達減少與腫瘤體積、血管浸潤程度、TNM 分期呈負相關[13]；血清外泌體miRNA-125 b 低水平表達的肝癌病人復發時間短，且人群總生存率較低[14]。

以上研究表明，外泌體具有成為診斷標志物的潛能。不同外泌體miRNA 表達水平的變化有不同臨床的意義，部分可作為早期肝癌的診斷指標并且一定程度上可提示肝癌的病理分期，部分可提示肝癌細胞的侵襲與轉移情況，且其作為肝癌生物標志物可為評估肝癌患者預后情況提供幫助。

3 外泌體與肝癌治療

目前，現代醫學治療肝癌已有多種手段，其中以肝臟切除為治愈肝癌的主要手段，但其可行性受肝臟儲備功能、余肝體積、腫瘤病理和全身情況等因素影響；此外，肝癌細胞對部分化療藥物也出現了耐藥，故尋找新的肝癌治療方法、研究提高肝癌治療效果的方式顯得尤為重要。目前研究表明，外泌體具有成為藥物載體以及治療靶點的臨床應用潛能。

3.1 外泌體作為藥物載體 外泌體易于從體液中提取，且具有低免疫原性、高生物滲透性和天然的靶向能力，是天然的內源性納米載體，作為藥物遞送載體有很大的優勢，也已成為目前研究的熱點。LOU G等[15]發現間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cell，AMSC）分泌的含miRNA-122 和miRNA-199外泌體可明顯增高HUh7 肝癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，此外將索拉非尼與含有miRNA-122 的脂肪AMSC 來源的外泌體腹腔注射于實驗動物，發現索拉非尼療效明顯提高。何淑芳等[16]發現由外泌體遞送的CDK1-siRNA 在細胞水平及動物水平均可有效抑制CDK1 基因的表達，具有顯著的抗腫瘤效果，并且對正常的肝細胞和組織不具有毒性，可實現肝癌的安全高效治療。以上實驗研究表明，外泌體是可以定向遞送內容物的高效運載體，促進調控腫瘤靶基因，具有提高療效、減少副作用的潛在價值。周儉等[17]將外泌體作為藥物遞送載體的優越性應用于臨床，發明了一種肝癌治療性外泌體藥物，通過預先降低或消除外泌體中促進肝癌進展的活性成分，使肝癌細胞產生的外泌體能夠在不具有促癌功能的同時保留與肝癌細胞的組織親和性，繼而攜載miR-26a 等miRNA 分子抑制肝癌進展。在中醫理論指導下，抗腫瘤中藥的多組分協同作用優于許多化療藥物，但其難溶性成分的不易吸收和無選擇性分布，使抗腫瘤中藥的治療效果未能全部發揮。目前研究發現，外泌體可承載中藥，將有效成分遞送至靶細胞，提高中醫藥防治肝癌的效果。在中藥活性成分姜黃素能夠抑制肝癌HepG2 細胞的生長和侵襲轉移能力的基礎上，研究發現[18]，以外泌體作為姜黃素的藥物載體，可明顯提高姜黃素在體內的濃度、藥物穩定性，且無明顯不良反應。表明外泌體有望成為一種有效的、現代化的中藥制備工藝與給藥方式。

3.2 外泌體作為治療靶點 外泌體miRNA 通過不同的機制影響著肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移，其中每一個過程都可以成為療法的靶點。外泌體所攜帶的miRNA-221 可影響細胞周期調節蛋白p27kip1、p57kip2，在此基礎上，切斷運載miRNA-221 的外泌體可以誘導肝癌細胞出現G1 期阻滯，有效地抑制肝癌細胞的增殖活動，并阻止其克隆形成及遷移侵襲[19]。針對肝癌細胞源性外泌體可使巨噬細胞PDL1 的表達升高并介導免疫逃逸，Wu B 等[20]將未處理肝癌細胞源性外泌體和經褪黑素處理的肝癌細胞來源外泌體對照進行體內、外研究，處理組巨噬細胞PD-L1 的表達下降，且通過巨噬細胞STAT3 途徑改變免疫抑制狀態。以上研究表明以參與免疫抑制、肝癌細胞增殖轉移的外泌體為靶點治療肝癌，具有良好的研究與臨床應用潛能。

4 總結

外泌體在肝癌發生、發展的多個環節中的作用以及應用價值是近年來的研究熱點。目前，在學術理論上已經廣泛認可外泌體存在于人體體液中，其所攜帶的miRNA 可作為肝癌診斷和預后評估的新生物標志物，并且其臨床意義可能優于傳統肝癌生物標志物。但外泌體所包含的miRNA 種類繁多且變化也不盡相同，如miRNA-665、miRNA-125b、miRNA-638 等數量的變化都可提示肝癌的發生，這意味著目前未明確以何種miRNA 為準來診斷原發性肝癌，變化量標準也未知。

筆者認為，局限于單一外泌體檢測試驗而缺乏可靠的識別與肝癌病理學特征相關的外泌體檢測指標體系限制了我國臨床上將外泌體應用于肝癌早期診斷，為加快將外泌體診斷潛力轉變為實用效益、提高肝癌早期臨床診斷率，應加強在建立外泌體檢測指標體系方面的研究。

許多研究已證實外泌體是防治肝癌的潛在靶點，但迄今為止，外泌體參與肝癌發生、發展進程中的作用機制仍未完全明確，外泌體如何調節受體細胞與供體細胞的功能以及如何改造外泌體并應用于臨床的研究仍較欠缺。外泌體作為藥物載體在中、西醫治療中都具有增強療效的作用，尤其是對于克服中藥難溶性成分的吸收有重要作用。筆者認為，中藥復方可成為中醫藥防治肝癌與外泌體結合研究和利用之間的聯系，借助于外泌體作為藥物載體的優勢，加強對具有抗肝癌作用的藥物、方劑的研究和利用，更好的發揮中醫藥優勢。