小麥單倍體育種方法研究進展

王 敏，閆貴云，左靜靜

（山西農業大學農學院，山西太原030031）

小麥常用的育種方法主要有雜交育種、誘變育種、單倍體育種、分子設計育種等[1-2]。其中，單倍體育種具有育種年限低、后代選擇效率高等[3]優點，是近年來科研工作者比較青睞的方法。普通小麥為異源六倍體，其染色體有42條，單倍體小麥為三倍體，有21條染色體[3]。因此，單倍體植株的基因型和表現型是完全一致的，為研究遺傳性狀和育種提供優質材料。目前產生小麥單倍體的途徑主要有離體培養、孤雌生殖等。筆者從這兩大類途徑出發，對其具體的方法進行對比分析和闡述，以期為后續的單倍體育種研究工作提供基礎。

1 離體培養

小麥離體培養是指通過無菌操作分離小麥的一部分，接種于人工配制的培養基上，在人工控制的條件下進行離體培養最終獲得再生植株的技術，主要包括花藥離體培養和花粉離體培養。

1.1 花藥離體培養

花藥離體培養是小麥單倍體育種中比較成熟的方法之一，該方法自20世紀70年代開始在我國推廣使用，但目前仍然存在基因依賴型、綠苗分化率低等難以克服的缺點。小麥的遺傳物質對花藥培養的影響最為顯著。LANTOS等[4]以4種小麥材料及10種F1的品種進行雙列雜交研究，結果表明，綠苗分化率最高的為85%，最低為6.3%。李雪等[5]通過9種小黑麥品系進行花藥培養研究，結果表明，TZ26、TZ25和P4的出愈率及綠苗分化率較高，石大1號的出愈率較高，但綠苗分化率低。宋運賢等[6]通過采用完全雙列雜交方法對部分皖北栽培小麥花藥誘導率進行一般配合力效應、特殊配合力效應分析，并估算其遺傳參數，結果表明，新麥208、煙農19、煤生0308具有較高的誘導率。大量研究表明，小麥花藥離體培養的出愈率和綠苗再生主要受核基因控制[7-8]，同時也可能受細胞質因素[9-10]的影響；愈傷組織和綠苗再生是彼此獨立的、受多基因控制的數量性狀[11-13]。趙林姝等[14]以突變新種質H307與優質早熟品種鄭麥9023為親本，構建了含有131個株系的重組自交系群體，檢測到4個與愈傷組織誘導率、綠苗產率、白苗分化率相關的QTL，分別位于5B、6B和3D染色體上；TORP[15]應用RFLP技術發現3個與綠苗率相關的QTL位點，分別在2AL、2BL、5BL上。這些結果為解決小麥花藥的基因型限制問題奠定了一定的理論基礎。

培養基和培養條件對花藥培養也有不可替代的作用。楊雪等[16]以小麥花藥為材料，對MS、N6、C17和K4這4種培養基在小麥花藥離體培養中愈傷組織的誘導作用進行了比較。結果表明，小麥花藥在4種培養基中愈傷組織誘導率從大到小排序為K4＞C17＞N6＞MS。楊雪等[17]以C17為基本培養基，研究了低溫預處理和聚乙二醇對小麥花藥出愈率的影響，結果表明，低溫預處理4 d的小麥花藥出愈率最高（2.108%），且穩定性較好（變異系數0.067），在培養基中加入100 mg/L PEG可顯著提高小麥花藥出愈率。趙永英等[18]通過在培養基中添加不同濃度的噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）探討其對小麥花藥培養的作用，結果表明，TDZ的作用與添加劑量及小麥基因型密切相關，在分化培養基中添加0.5 mg/L的TDZ能夠顯著提高綠苗分化率（最高可達50.0%）和綠苗與白苗比率（最高為1.9）。呂學蓮等[19]以103份不同基因型小麥為材料進行花藥培養，結果表明，在愈傷組織誘導方面，C17培養基明顯優于W14，而在綠苗分化方面，W14培養基誘導產生的愈傷組織綠苗分化的效果更好，同時高溫培養比不進行高溫培養的愈傷誘導率高。因此，要選擇合適的培養基和培養條件進行花藥離體培養，以期提高小麥的出愈率，降低白化苗的產生。

1.2 花粉離體培養

花粉培養是指當花粉發育到一定階段，從花藥中取出花粉所進行的單細胞無菌培養。小麥花粉培養又稱小孢子培養，主要通過胚胎途徑直接發育成植株，避免了愈傷組織階段，減少因孢子體變異而引起的農藝性狀退化，顯著提高單倍體產生頻率和減少白化苗的產生量[20]。

1993年，TUVESSON等[21]首先培養出了小麥的小孢子植株。隨后，小麥的花粉培養技術得到了較廣泛的研究和應用。胡含等[22]研究表明，90%的小麥花粉植株為染色體構型較穩定的單倍體和二倍體，其余10%的花粉植株為非整倍體、多倍體和混倍體，豐富和發展了小麥花粉離體培養的遺傳學理論。李波等[23]以4個小麥品種為材料，對培養基中的蔗糖濃度、外源激素等對離體花粉中小孢子細胞分裂啟動的誘導效果進行了研究。結果發現，小麥花粉培養的最適蔗糖濃度為3%，蔗糖濃度高于9%時不能啟動花粉粒的脫分化及雄核發育，這說明外源激素的存在是花粉脫分化并進入雄核發育的必要條件，2，4-D在誘導花粉粒轉向孢子體發育的過程中起主要作用。章靜娟等[24]進一步研究不同雜交組合、不同培養基的因素對F1花粉植株再生的影響，結果表明，F1花粉植株再生頻率在不同組合之間存在顯著性差異；植物生長調節劑4PU-30和C17、K3、W14等3種培養基對花藥的花粉出愈率、綠苗分化率和綠苗產量也產生影響。侯立江等[25]研究表明，小麥成熟花粉在20%蔗糖＋10% PEG4000＋40 mg/L H3BO3＋3×10-3mol/L Ca（NO3）2＋10 mg/L VB1中28℃培養30 min，通過鏡檢觀察，可誘導萌發頻率高達90%以上。楊隨莊[26]則研究發現，植物血凝素（PHA）對小麥花粉的誘導頻率也有影響。朱宏等[27]研究發現，對幼穗花藥的低溫前處理有利于花粉細胞分裂的啟動，經6～9 d 7℃前處理于25～27℃下24～36 h培養，有利于花粉細胞分裂的啟動。花粉離體培養的再生能力不僅僅與親本密切相關，在進行小麥花粉培養時，要選擇農藝性狀優良的親本，同時，選用合適的培養基和外源激素在適當的培養條件下進行培養，將有利于提高小麥花粉植株的再生頻率。

2 孤雌生殖

孤雌生殖是指雌配子體不經過受精，在自身基因控制或其他因素刺激下直接發育成胚的一種無融合的生殖方式[28]。由于自發產生率低，常采用人工誘導的方法進行孤雌生殖，常用的方法有輻射花粉、化學誘導、異種屬花粉延遲授粉、異種屬細胞質-核替換法、遠緣雜交等。

2.1 輻射花粉

輻射花粉授粉是指將父本花粉通過紫外線或γ、X、60Co、32P等射線照射后，然后授粉給去雄的母本，從而影響其受精過程誘發的孤雌生殖。輻射花粉誘導雌核發育單倍體的原理一般認為有2種：一種認為，花粉被射線照射時，生殖核喪失活力，只能刺激卵細胞分裂發育，不能起到受精的作用；另一種觀點認為，生殖核染色體數目異常不能與卵細胞配對導致無法受精[29]。一般認為，該方法與小麥的基因型、輻射源和劑量等因素有關。李德炎[30]用被X射線照射過的1粒小麥花粉給未授粉的小麥柱頭授粉，誘導率為17.6%。胡啟德等[31]用60Co-γ線處理普通小麥的花粉，給去雄的雜種F1植株授粉，誘導孤雌生殖，結果表明，劑量6 000 Gy的誘導成功率最高為7.5%。王獻平[32]在誘導小麥-中間偃麥草易位系的工作中得到了比較理想的結果（易位頻率為2.9%），其通過進一步研究報道了利用低劑量γ射線輻射花粉的方法誘導小麥-濱麥易位系，這為小麥利用其他種屬的優良基因改善其自身的品種奠定了基礎。

2.2 化學誘導

化學誘導是指將小麥母本去雄，然后用化學試劑誘導小麥進行孤雌生殖。這種方法操作簡單，目前發現，DMSO、PCPA、KT、2，4-D、NAA、GA3、TRTA、DMSO＋對氯苯氧乙酸、DMSO＋KT、DMSO＋GA3、DMSO＋NAA、DMSO＋鄰氯苯氧乙酸、DMSO＋KT＋鄰氯苯氧乙酸等都可以成功地誘導小麥進行孤雌生殖[33]。不同的化學試劑和濃度對小麥的誘導效果不同。孫耀中等[34]研究發現，動物雌激素的誘導效果按照誘導結實率的大小排序為甲地孕酮（1.34%）＞炔諾酮（1.01%）＞乙烯雌酚（0.98%）；對氯苯氧乙酸以500 mg/L的誘導結實率最高，為4.6%，肌醇以100 mg/L的誘導結實率最高，為4.2%，2，4-D以10 mg/L的誘導結實率最高，為3.4%。陳傳永等[35]以16個品系為材料，在3月底用1 500 mL/hm2津奧啉對小麥進行去雄處理，然后套袋隔離直至收獲。5月份用不同的誘導劑進行孤雌生殖誘導，結果表明，適當濃度的NAA、GA3、Col、MH都有利于誘導小麥，且含有Ca（NO3）2的配方中，結實率比較高。其具體的誘導機制不詳，仍需進一步探究。

2.3 異種屬花粉延遲授粉

卵細胞接受親緣關系較遠的花粉很難受精，但卻能受到刺激從而孤雌生殖產生單倍體。異種屬花粉誘導小麥孤雌生殖的誘導率一般比較低，因此，往往結合延遲授粉的方法提高誘導率。常用的異種屬一般為黑麥，但誘導結實率一般不超過5%[36-37]。陶少武等[38]研究發現，用由硬粒小麥和黑麥雜交并加倍后的六倍體小黑麥作為授粉者，結實率最高可達到17.7%，可能是由于六倍體小黑麥容易在普通小麥柱頭上萌發并順利到達胚囊，只能刺激卵細胞分裂，自身精核不易與卵細胞融合而最終崩解。多數研究表明，一般延遲7～9 d授粉的效果較好[30，35-36]。苗芳等[39]采用延遲7～9 d的授粉和石蠟切片的方法，研究了黑麥花粉、小黑麥花粉以及黑麥和小黑麥花粉分段授粉誘導小麥孤雌生殖，結果表明，用黑麥和小黑麥花粉分段授粉時，不僅易形成胚乳，而且易形成同時具有胚和胚乳的胚囊，其誘導頻率最高為23.1%。

2.4 異種屬細胞質-核替換法

KIHARA[40]研究發現，某些山羊草的細胞質和普通小麥的細胞核組成的核質雜種，具有雄性不育的特點，能夠產生較高頻率的單倍體。目前已經發現的細胞質供體[41]主要有：尾狀山羊草、粘果山羊草、易變山羊草、高大山羊草、歐山羊草、離果山羊草、小亞山羊草和小傘山羊草、二角山羊草和偏凸山羊草。這些山羊草在作為細胞質的供體時各有優缺點，誘導率也各不相同。多數試驗[42-44]表明，外源細胞質誘導小麥單倍體的機制主要受細胞核和細胞質的雙重控制，小麥1B/1RS易位系的1R短臂上有一個控制孤雌生殖的顯性基因Ptg，該基因與細胞質互作時產生單倍體。劉慶法等[45]研究表明，只要雌配子體帶有Ptg基因即有發育成單倍體的潛力；父母本基因型與單倍體頻率有密切關系，但父本是否具有Ptg基因與誘導頻率無關。Ptg基因在普通小麥細胞質背景下也可以表達，但外顯率較低[46]。

2.5 遠緣雜交（染色體消除法）

遠緣雜交技術可以利用異種的特殊優良性狀，把有益的基因轉移到小麥中，從而克服常規育種的缺點，擴大小麥的種質資源。目前，應用遠緣雜交技術獲得小麥單倍體中最廣泛使用的是玉米花粉和球莖大麥。

普通小麥和玉米之間雜交，能夠發生高頻率的受精作用和胚胎形成。小麥×玉米產生的雜合子核型高度不穩定，在受精后雜種合子的最初幾次分裂中，父方染色體很快排除，形成小麥單倍體的幼胚[47]。丁明亮等[48]用糯、甜糯、甜、超甜4種類型共8個玉米品種分別與6個小麥DH系雜交誘導產生小麥單倍體胚，結果表明，4種玉米類型間平均單倍體胚得胚率以甜糯型最高（33.86%）、超甜型最低（29.59%），相同玉米類型而基因型不同的玉米品種間單倍體胚得胚率差異大于玉米類型間單倍體胚得胚率的差異。劉琨等[49]探討簡化去雄方法對成胚率的影響，結果表明，剪穎不去雄的去雄效率比常規去雄高5倍以上，單倍體胚成胚率相同，可作為小麥×玉米雜交中批量產生小麥單倍體的高效去雄方法。研究表明，Kr1基因是小麥遠緣雜交不親和主效基因。蔡華等[50]比較了小麥自花授粉和小麥×玉米遠緣雜交2個過程中Kr1基因的表達差異，結果表明，DNA甲基化修飾參與了Kr1基因在小麥×玉米遠緣雜交中的表達調控。

KASHA等[51]研究認為，球莖大麥與母本株授粉后，在形成胚胎的早期，球莖大麥的染色體在合子中逐漸消失（或被排除），僅剩余母本的染色體，幼胚經離體培養得到單倍體植株。胡道芬等[52]利用德國球莖大麥作為父本、4種普通小麥為母本得出小麥基因型不同，則結實率和出苗率不同。李大瑋等[53]研究得出，小麥經用球莖大麥花粉授粉14 d后的未成熟胚，經2℃的冷貯處理后能夠提高再生成植株的頻率。胡超等[54]用石蠟切片法，對普通小麥異源2號、中國春與球莖大麥遠緣雜交受精過程和早期胚胎發育進行比較觀察，結果表明，異源2號和中國春與球莖大麥遠緣雜交，其受精和胚胎發育存在著明顯差異，造成這一差異的原因可能是由于異源2號僅具1對Kr基因，而中國春具有Kr1、Kr2、Kr3等3對雜交親和性基因。

3 討論

小麥單倍體的育種已經有了較廣泛的研究，每種方法各有優缺點，但大都存在誘導率低、綠苗分化率低等缺點，需要科研工作者深入結合小麥的基因和遺傳調控等進行具體的分析和研究。同時，可以通過小麥不同基因型的研究，將上述多種誘導方法相結合，進行抗病、抗鹽堿、抗倒伏等品種的選育。相信隨著染色體工程的逐步建立和應用，小麥單倍體育種的工作將會得到更為廣闊的發展。