文山州獸醫(yī)實驗室PCR檢測問題及對策

李碧鳳 趙敏 張紹衛(wèi) 袁正春

（云南省文山州動物疫病預(yù)防控制中心 663000）

PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是近幾十年來發(fā)展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一[1]，其已發(fā)展為成熟的病原學(xué)檢測技術(shù)之一。自1985 年P(guān)CR 技術(shù)問世以來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR 技術(shù)不僅對世界生物醫(yī)學(xué)的研究有巨大推動作用，而且在獸醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用及基層獸醫(yī)生產(chǎn)實踐檢測工作方面也發(fā)揮著越來越重要的作用。文山州動物疫病預(yù)防控制中心于2017 年建成獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室，中心獸醫(yī)人員缺乏分子生物學(xué)技術(shù)相關(guān)知識，且基層獸醫(yī)人員工作內(nèi)容復(fù)雜，學(xué)習(xí)交流圈子窄、信息閉塞，對分子生物學(xué)PCR 檢測技術(shù)原理及其在基層獸醫(yī)實驗室中的應(yīng)用認(rèn)識有限。因此，全面分析總結(jié)2017～2019 年文山州獸醫(yī)實驗室檢測技術(shù)人員在應(yīng)用PCR 檢測方法中檢（監(jiān)）測樣品、儀器設(shè)備的使用、檢測技術(shù)人員及實驗室生物安全等方面存在的問題，并提出實際有效的對策與措施，以期為基層獸醫(yī)更好地運用PCR 檢測技術(shù)開展基層動物疫病防控工作提供一些參考。

1 文山州獸醫(yī)實驗室及PCR 應(yīng)用概況

根據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》，動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)按照國務(wù)院獸醫(yī)主管部門的規(guī)定，對動物疫病的發(fā)生、流行等情況進行監(jiān)測。地市一級的動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)是執(zhí)行重大動物疫病監(jiān)測的一線主體，其獸醫(yī)實驗室承擔(dān)著動物疫病診斷、檢測、動物免疫狀況調(diào)查、監(jiān)測等工作，是動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)的技術(shù)保障與根基。隨著國家對獸醫(yī)系統(tǒng)實驗室建設(shè)投資力度的加大，文山州動物疫病預(yù)防控制中心于2017 年在云南省動物疫病預(yù)防控制中心的協(xié)助和技術(shù)指導(dǎo)下，文山州動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室建成并投入使用。文山州動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室是文山壯族苗族自治州唯一一個具有PCR 病原學(xué)檢測、監(jiān)測技術(shù)能力的實驗室。獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室運用PCR 技術(shù)建立了符合當(dāng)?shù)馗咧虏⌒郧萘鞲胁≡瓩z測、監(jiān)測的PCR 檢測方法，并建立了文山州高致病性禽流感監(jiān)測預(yù)警體系[2]，在2017～2019 年成功控制和處置了文山州區(qū)域內(nèi)的H7N9亞型禽流感及其他重大動物疫情。

文山州動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室的建設(shè)，為文山州動物疫病的檢測、監(jiān)測技術(shù)從血清學(xué)抗體檢測逐步向病原學(xué)PCR 檢測技術(shù)方向發(fā)展提供了基礎(chǔ)平臺。于2018年中心實驗室因?qū)嶋H病原學(xué)檢測與監(jiān)測工作的需求，新購入一臺PCR 儀。2019 年因非洲豬瘟疫情的爆發(fā)，檢測樣品數(shù)量的劇增購入一臺全自動核酸提取儀；先進儀器設(shè)備的補充，促進了文山州獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室高致病性禽流感、非洲豬瘟、新城疫、豬瘟、高致病性豬藍耳、口蹄疫、小反芻獸疫等病原學(xué)PCR 檢測、監(jiān)測工作的快速開展。2017～2019 年獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室運用PCR 技術(shù)開展文山州活禽交易市場、規(guī)模養(yǎng)禽場以及預(yù)警監(jiān)測點的禽流感監(jiān)測，全面掌握全州禽流感疫情動態(tài)，做到底子清、情況明，為全州禽流感的疫情防控提供有效手段，有效阻斷大規(guī)模禽流感疫情的爆發(fā)。同時對豬瘟、高致病性豬藍耳、口蹄疫、小反芻獸疫等疫病開展緊急PCR 檢測與集中PCR 病原學(xué)監(jiān)測，為文山州動物疫控中心開展重大動物疫病防控決策提供科學(xué)的實驗數(shù)據(jù)。因非洲豬瘟爆發(fā)，2019 年病原學(xué)檢測、監(jiān)測工作在新增儀器的有效運轉(zhuǎn)下，完成大批量ASF 樣品PCR 檢測，為基層獸醫(yī)及時檢測診斷非洲豬瘟可疑樣品、快速采取非洲豬瘟防控措施提供了科學(xué)技術(shù)支持。

2 應(yīng)用PCR 檢測方法存在的問題

2.1 PCR 檢（監(jiān)）測樣品

在PCR 樣品品質(zhì)問題。高致病性禽流感、新城疫病原學(xué)的檢測與監(jiān)測，其樣品主要采集禽類的咽喉、泄殖腔、環(huán)境、運輸工具棉拭子，基層獸醫(yī)人員對采集棉拭子所需的保存液的配制及加入多少在實際操作中存在許多問題。很多基層獸醫(yī)人員為了方便工作省去保存液的滅菌步驟；有的樣品里無保存液；有的則加入保存液的量只夠棉拭子吸取無法用于核酸提取；而采集喉氣管組織樣品時又出現(xiàn)只見喉頭不見氣管或只見氣管不見喉頭；以及樣品腐敗變質(zhì)、盛放隨意等問題。豬瘟、高致病性豬藍耳病檢測、監(jiān)測的樣品大多采集全血或脾肺或扁桃體，這在基層常出現(xiàn)采集的是血清不是全血；采集全血的試管因保存不當(dāng)而破裂；采集的組織太大或太小不符合要求。非洲豬瘟檢測與監(jiān)測的樣品也出現(xiàn)同樣的問題與現(xiàn)象。許多檢測、監(jiān)測樣品的包裝、保存與運輸上不符合國家《高致病性病原微生物菌（毒）種或者樣本運輸包裝規(guī)范》規(guī)定。樣品的標(biāo)記與采樣表填寫不清楚、信息不全等。這些不規(guī)范、低品質(zhì)樣品無法準(zhǔn)確有效地用于PCR 實驗，不能真實反映出病原情況，無法溯源和為實際的疫情防控工作提供科學(xué)的預(yù)警依據(jù)。

2.2 PCR 檢測儀器設(shè)備的使用

PCR 病原學(xué)檢測技術(shù)中重要的幾種儀器設(shè)備主要是冷凍離心機、低溫冰箱、生物安全柜、全自動核酸提取儀、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。這些儀器的操作與維護關(guān)系到PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、有效性。如普通的低溫冰箱，通常-20℃儲存PCR 試劑（酶、引物、dNTP 混合物等），若沒有正常的維護與溫度檢查記錄，冰箱因不明原因不能維持-20℃工作，實驗室人員不能及時發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致保存在這個冰箱中的PCR 試劑（尤其是酶與引物）不穩(wěn)定，檢測時影響到實驗結(jié)果（實際工作中出現(xiàn)一次情況，導(dǎo)致檢測的實驗結(jié)果不可用）。生物安全柜的正確使用關(guān)系到整個PCR 實驗室污染源的防控，其消毒、清潔環(huán)節(jié)是對PCR 實驗的核酸提取、體系配置等操作外環(huán)境的控制。全自動核酸提取儀是獲取樣本核酸的關(guān)鍵步驟，熟悉儀器的性能、規(guī)范操作使用該儀器是PCR 實驗成功的關(guān)鍵步驟。使用全自動核酸提取儀時不可忽略核酸提取試劑盒的查驗，該試劑盒為試劑公司批量生產(chǎn)，其加入的試劑不免也會出現(xiàn)漏加現(xiàn)象，在實際工作中就遇到有些試劑盒中漏加磁珠的問題，此外手動加入樣品時其編號不可打亂，以免樣品與最終的實驗結(jié)果不能一一對應(yīng)，更不能少加或漏加提取核酸用的酶。PCR 實驗中PCR 儀的使用與維護對PCR 檢測的結(jié)果具有直接影響，PCR程序的設(shè)置因不同病原體檢測其程序各不相同，切勿在使用過程中因慌忙而點錯程序，程序運行前一定檢查核對正確后再點擊開始。電泳儀的使用要注意電泳液的配置與電源線正負(fù)極的插入，長時間重復(fù)使用電泳槽中的電泳液會影響樣品電泳的效果，應(yīng)適時更換新配置的電泳液，放置電泳的膠塊時切忌方向不能放反，否則PCR 產(chǎn)物跑出膠塊后無法獲得實驗結(jié)果。凝膠成像系統(tǒng)是得出PCR 試驗結(jié)果使用的最后儀器，對于該儀器的使用需要做好培訓(xùn)與指導(dǎo)，實際操作中步驟雖然簡單，但不可粗心大意。

2.3 PCR 檢測技術(shù)人員

一是檢測技術(shù)人員缺乏的問題。在基層獸醫(yī)實驗室人員配備數(shù)量與實際需求不符[3]，這是基層獸醫(yī)實驗室中的普遍現(xiàn)象；文山州中心獸醫(yī)實驗室僅有3 名PCR 實驗室檢測技術(shù)人員，這與實際實驗室檢測、監(jiān)測工作需求不符；基層獸醫(yī)從事實驗室工作多為兼職人員，中心3 名實驗室檢測技術(shù)人員除承擔(dān)高致病性禽流感、新城疫、非洲豬瘟、豬瘟、高致病性豬藍耳、口蹄疫、小反芻獸疫等病原學(xué)檢測與監(jiān)測工作外，還負(fù)責(zé)抗體監(jiān)測、春秋防疫工作、獸藥飼料檢測及其他行政工作等。二是人員的基礎(chǔ)知識、檢測技術(shù)問題。實驗室檢測技術(shù)人員缺乏分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)知識，疏于對PCR 技術(shù)知識的學(xué)習(xí)與更新，對檢測原理知其然而不知其所以然，無法正確判斷或發(fā)現(xiàn)實際檢測工作中的許多細(xì)節(jié)問題。如為何一人所做的PCR 實驗其陰、陽性對照組出現(xiàn)不同的結(jié)果（假陽性、假陰性）；為何同一樣品重復(fù)多次檢測，其結(jié)果各不相同；為何有些樣品PCR條帶出現(xiàn)拖尾，有些樣品條帶明亮整齊但卻不是目的條帶；PCR 電泳中為何有些產(chǎn)物只是肉眼可見一條染色帶，有些產(chǎn)物則肉眼可見兩條染色帶等問題。基層獸醫(yī)實驗人員大多知道做PCR 實驗的整個流程，而缺乏分析和解決實驗中實際問題的能力，中心獸醫(yī)實驗人員無有效途徑進行PCR 檢測技術(shù)知識的交流學(xué)習(xí)與更新。目前中心獸醫(yī)實驗室人員在從事病原學(xué)檢測工作前多從事屠宰檢疫或其他方面的工作，且年齡普遍偏大（年齡在50 歲左右），對精細(xì)的分子生物學(xué)PCR 檢測工作存在一些操作上粗心大意的問題，不熟悉移液槍的使用導(dǎo)致取液不準(zhǔn)確；動作該輕柔的地方反而劇烈震蕩；配制不同PCR 檢測體系容易混淆等。

2.4 PCR 實驗室生物安全問題

獸醫(yī)實驗室的生物安全是開展動物疫病病原正常檢測與監(jiān)測工作的重要保障，是實驗室人員身體健康與安全的基本保障。獸醫(yī)實驗室工作人員在進行PCR 病原學(xué)監(jiān)測與檢測工作時接觸的病原樣本復(fù)雜多樣，其中不乏一些人畜共患病（高致病性禽流感、布魯氏菌病、狂犬病等）樣品。如2019 年12 月，某研究所人員因做實驗感染了布魯氏菌病（簡稱布病），用血的教訓(xùn)證明生物安全實驗室是一把“雙刃劍”，它既是動物疫病防控的實驗技術(shù)平臺也是最易造成病原傳播和感染人員的危險場所[4]，基層獸醫(yī)實驗室人員長期工作在生產(chǎn)一線，存在極大的生物安全隱患[5]，因此，PCR 實驗室的生物安全管理與防護十分重要。中心獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室在辦公樓三樓，除獸醫(yī)實驗室外還有3 間相鄰的辦公室，獸醫(yī)實驗室的分子生物安全問題不僅限于實驗室區(qū)域也關(guān)系到外圍辦公區(qū)和單位周邊的廣大居民的安全問題。

3 采取的對策與措施

3.1 規(guī)范樣品的采集、包裝、運輸

針對采集樣品不規(guī)范的問題，文山州動物疫病預(yù)防控制中心邀請專業(yè)技術(shù)人員對基層獸醫(yī)進行多次動物疫病檢測、監(jiān)測采樣技術(shù)培訓(xùn)。通過與基層獸醫(yī)面對面溝通交流，從樣品采集、采集工具的運用、采集信息的填寫、不同動物疫病樣品的采集方法等方面答疑解惑，從而使基層獸醫(yī)人員對采集合格的動物疫病病原學(xué)檢測、監(jiān)測樣品有了充分的認(rèn)識，并在實際采樣工作中執(zhí)行到位，有效提高文山州動物疫病病原學(xué)PCR 檢測、監(jiān)測樣品的品質(zhì)。這在多次培訓(xùn)后收到的檢測、監(jiān)測樣品情況中得以體現(xiàn)，樣品品質(zhì)基本符合對應(yīng)檢測、監(jiān)測病原的條件與要求，大大方便了檢測工作的開展及動物疫病病原的追溯。針對樣品包裝與運輸，中心實驗室采取集中培訓(xùn)指導(dǎo)，強制性按不同動物疫病病原樣本運輸包裝規(guī)范執(zhí)行送樣，若不符合規(guī)定的則拒絕接收和檢測樣品，出現(xiàn)問題的則采取嚴(yán)厲處罰措施，并通報批評。

3.2 規(guī)范PCR 檢測儀器設(shè)備的使用與維護

檢測儀器設(shè)備的使用與維護是確保PCR 實驗正常進行的基礎(chǔ)設(shè)施保障，是技術(shù)保障中的基石。針對儀器設(shè)備的有效使用與維護，中心獸醫(yī)實驗室制定了分子生物學(xué)儀器設(shè)備檔案管理、儀器設(shè)備使用與維護程序文件，儀器設(shè)備管理員實名制管理與維護。并采取專人培訓(xùn)指導(dǎo)實驗室檢測人員對不同儀器設(shè)備的正確、有效使用，最大化地提高儀器設(shè)備的有效利用率。建立儀器設(shè)備使用記錄實時登記制度，不僅有利于檢測技術(shù)人員時刻規(guī)范自我檢測操作過程，且便于實驗室質(zhì)量監(jiān)督人員的技術(shù)監(jiān)督管理。同時為PCR 檢測實驗過程留下痕跡可查可驗，有助于實驗室檢測技術(shù)人員查找實驗過程中出現(xiàn)的細(xì)節(jié)問題。

3.3 加強PCR 檢測技術(shù)人員的管理與培訓(xùn)指導(dǎo)

基層獸醫(yī)實驗技術(shù)人員需要通過不斷學(xué)習(xí)與交流豐富分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識，訓(xùn)練及規(guī)范PCR 實驗操作技術(shù)，提高實驗操作技術(shù)與分析解決實驗問題的能力。中心為獸醫(yī)實驗技術(shù)人員提高綜合技術(shù)能力采取“送出去，請進來”的培養(yǎng)方式，即送技術(shù)人員出去學(xué)習(xí)的同時也請專家到本地培訓(xùn)指導(dǎo)。與此同時，增加實驗室檢測技術(shù)人員在分子生物學(xué)知識及技術(shù)方面的交流學(xué)習(xí)機會，擴寬實驗技術(shù)人員對PCR 技術(shù)及新發(fā)展的其他實驗技術(shù)的學(xué)習(xí)途徑。且通過加強引導(dǎo)檢測技術(shù)人員的學(xué)習(xí)，優(yōu)化試劑、儀器、樣本、環(huán)境等的管理，強化檢測方法、檢測過程的管控，積極參與國家、省級組織的檢測能力比對實驗等外部質(zhì)量控制[6，7]，有效地提高中心獸醫(yī)實驗室的PCR 檢測技術(shù)能力。

3.4 加強獸醫(yī)實驗室生物安全管理

中心獸醫(yī)實驗室通過制定相應(yīng)的實驗室生物安全操作技術(shù)規(guī)范、廢棄物處理操作程序、實驗室生物安全程序文件及實驗室生物安全標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等，全面涵蓋國家《實驗室生物安全通用要求》中的各項生物安全管理[8]。且對獸醫(yī)實驗室開展管理評審和內(nèi)部審核工作，對獸醫(yī)實驗室涉及的病原微生物及從事的實驗活動各方面進行風(fēng)險評估，以風(fēng)險評估為基礎(chǔ)，從根本上確保實驗室生物安全[9]。加大實驗室生物安全防護機制的建設(shè)與措施的落實，提高基層獸醫(yī)實驗室檢測人員生物安全防護意識，確保實驗室各項生物安全技術(shù)達標(biāo)，保證獸醫(yī)分子生物學(xué)實驗室工作安全的有序開展。