植物WRKY轉錄因子研究進展

孫 超，王翠香，梁 燕，李春明，張兆云，矯興杰，韓傳明*

（1.山東省林業科學研究院，山東濟南250014；2.國家林業和草原局華東核桃工程技術研究中心，山東濟南250014；3.海陽市森林資源監測保護服務中心，山東海陽265100；4.煙臺市牟平山省級自然保護區管理中心，山東煙臺264100）

轉錄因子的調控是維持細胞基因調控完整性的基本步驟，它們在植物生長發育、抵御生物脅迫和非生物脅迫中起著至關重要的作用[1，2，3]。1994年，第一個WRKY轉錄因子成員SPF1（Sweet-Potato-Factor-1）從甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出來[4]。此后，大量的WRKY 家族成員在幾十種植物中被相繼發現，其中，擬南芥中含有72 個成員[5]，水稻中有102 個成員[6，7]，大豆中有197 個[8]，棉花中有116 個[9]，油菜中有46 個[10]，黃瓜中有55 個[11]，蘋果中有116個[12]，石榴中有69 個[13]，番茄中有81 個[14]，楊樹中有104 個[15]，巨桉中有79 個[16]，橡膠樹中有81 個[17]，苜蓿中有29 個[18]。

本文將對WRKY轉錄因子的結構和分類、在植物生長發育、對生物脅迫和非生物脅迫響應防御等過程中發揮的調控功能進行闡述，為全面研究WRKY轉錄因子家族的調控和深入剖析每個成員的作用機理提供思路。

1 WRKY轉錄因子的結構與分類

WRKY轉錄因子最顯著的特征是含有高度保守的60 個氨基酸構成的WRKY 結構域，該結構域的N 末端有保守的WRKYGQK 七肽序列，C 末端有Cys(2)-His(2)型或Cys(2)-HisCys 型鋅指結構。七肽序列的數量和鋅指結構的類型決定了WRKY轉錄因子結合靶基因啟動子順式元件W-box（TTGACC/T）的親和能力，也是WRKY轉錄因子家族分類的依據[19，20]。WRKY轉錄因子分為3 類。第Ⅰ類含有兩個WRKYGQK 序列，第Ⅱ類和第Ⅲ類含有一個WRKYGQK 序列。第Ⅰ類和第Ⅱ類具有相同的鋅指結構，為C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，第Ⅲ類的鋅指結構C-X7-C-X23-H-X1-C。依據氨基酸序列的差異，第Ⅱ類又可以進一步細分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe5 個亞類。擬南芥的72 個WRKY轉錄因子中，第Ⅰ類有32 個，第Ⅱ類有26 個，第Ⅲ類有14 個。石榴WRKY轉錄因子家族的69 個成員中，第Ⅰ類有14 個成員，第Ⅱ類有45 個成員，第Ⅲ類有10個成員。

2 WRKY轉錄因子在植物生長發育中的作用

GA 是一類重要的激素，參與了植物種子萌發、營養生長、開花等過程。對水稻基因組序列分析得到的77 個WRKY 基因進行鑒定發現，OsWRKY71在糊粉層細胞中高表達并且GFP：OsWRKY71 被定位于糊粉層細胞核。GA 信號可誘導轉錄激活因子OsGAMYB 的表達，同時，OsGAMYB 可激活α-淀粉酶基因Amy32b 的表達。進一步研究發現，OsWRKY71 通過與Amy32b 啟動子上W-box 的結合，阻斷了OsGAMYB 對Amy32b 的激活。在水稻糊粉層細胞中，OsWRKY71 是GA 信號的轉錄抑制因子[21]。WRKY 蛋白WRKY18、WRKY40 和WRKY60通過與ABA 受體結合，作為ABA 信號負調控因子在擬南芥種子萌發和生長過程中起作用[22]。

褪綠是葉片衰老過程中可見的部分。葉綠素和光合反應器的分解使葉片呈現淺綠色或淡黃色。當葉片出現這些跡象時，衰老程序早已在分子水平上啟動了。在多種植物中的研究證明了WRKY轉錄因子廣泛參與了植物的衰老過程，其中WRKY53 與H2O2、ROS（reactive oxygen species）、細胞內Ca2+水平、ABA、JA 等相關聯，被證明是植物衰老調控網絡的中心之一[23]。轉棉花GhWRKY22 基因的擬南芥植株表現出雄性不育，花粉粒數量較野生型減少。與野生型相比，過量表達GhWRKY22 的轉基因擬南芥植株中JA 生物合成相關基因的表達上調，而JA抑制因子JAZ1 和JAZ8 的表達下調。酵母單雜交和芯片qPCR 分析表明GhWRKY22 通過直接結合JAZ 基因的啟動子來調控花藥/花粉發育[24]。

3 WRKY轉錄因子在植物生物脅迫中的作用

植物的生物脅迫主要包括病原體、病原相關分子模式（PAMPs，Pathogen -associated molecular patterns）、激發子等。通常情況下，脅迫信號的感知是通過膜結合或可溶性受體或激活植物激素依賴過程來。在擬南芥中，由PROPEP 基因編碼的受體激酶PEPR1 和PEPR2，可感知植物損傷相關的分子模式，以增強防御反應。WRKY33 以依賴激活的方式與2 個受體激酶基因的啟動子結合并調節它們的表達[25]。煙草花葉病毒（TMV）和SA 都能誘導煙草tWRKY3 和tWRKY4 的表達；大豆細菌性斑點病菌（Pseudomonas syringae pv.glycinea）、SA、MeJA 等都能誘導編碼WRKY轉錄因子基因NtEIG-D48 的表達。這說明WRKY轉錄因子通過調控不同防御基因的表達，參與了煙草多個防御途徑[26]。在擬南芥葉片細胞的PAMP 防御中發現，細菌或真菌病原體都可以啟動AtWRKY22 和AtWRKY29 結合FLS2 起作用的防御途徑[27]。玫瑰56 個編碼WRKY轉錄因子的基因中，有19 個基因受灰霉菌（Botrytis cinerea）誘導表達。通過VIGS（virus-induced gene silencing）的方法將花瓣中RcWRKY41 基因沉默，接種灰霉菌后發現：與對照相比，RcWRKY41 基因沉默花瓣的病斑明顯增大，表現出更嚴重的病癥[28]。通過對斜紋夜蛾（Spodoptera littoralis）進食前后的擬南芥轉錄組分析發現，食草行為導致擬南芥WRKY18 和WRKY40 在內的42 個轉錄因子誘導表達，這也暗示著WRKY18 和WRKY40 在抵御斜紋夜蛾進食行為對植物造成的傷害中起著重要的作用[29]。

4 WRKY轉錄因子在植物非生物脅迫中的作用

植物的非生物脅迫主要包括高溫、低溫、干旱、鹽害、機械損傷、缺素、滲透等。WRKY轉錄因子通過復雜的信號轉導途徑參與植物的非生物脅迫響應，并發揮了重要的調控作用。一個WRKY 蛋白通常參與多個脅迫響應的調控，有些甚至能同時在生物脅迫和非生物脅迫中起作用。近年來，人們基于WRKY 基因的過量表達和敲除、基因組和轉錄組分析、基因芯片分析、實時熒光定量PCR 等方法和技術，分析和鑒定了多種植物中WRKY轉錄因子在非生物脅迫下的功能。

4.1 高溫和低溫脅迫

高溫和低溫脅迫是主要的非生物脅迫。植物在遭遇高溫或低溫脅迫時，WRKY轉錄因子通過調控下游相關基因的表達，幫助植物抵抗溫度的為害。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的啟動子中含有多個非生物脅迫相關的順式作用元件。TaWRKY1 在高溫或ABA 誘導下微弱上調，在低溫誘導時下調；TaWRKY33 在高溫、低溫、ABA 或MeJA 的誘導下都高表達。TaWRKY1 和TaWRKY33 基因的過量表達都能激活下游脅迫相關基因的表達，轉基因擬南芥在多種脅迫下的發芽率和根生長量均高于對照。脫水處理時，轉TaWRKY33 基因擬南芥株系比轉TaWRKY1 基因擬南芥株系和對照表現出較低的脫水率。更重要的是，轉TaWRKY33 基因擬南芥株系耐高溫脅迫的能力增強[30]。在高溫脅迫下，擬南芥WRKY25 和WRKY26 基因的表達誘導上調，而WRKY33 基因的表達被抑制。與野生型擬南芥相比，3 個單突變體wrky25、wrky26 和wrky33 對熱激響應微弱，而雙突變體wrky25wrky26、wrky25wrky33和三突變體wrky25wrky26wrky33 對熱脅迫的敏感性顯著增加，同時表現出種子發芽率降低、存活率下降和電解質外滲升高。WRKY25、WRKY26 和WRKY33 基因的過量表達都能增強轉基因植株抵御熱激脅迫的抗性。進一步的研究發現，通過正向調節ETH 激活和熱激蛋白相關的信號途徑，WRKY25、WRKY26 和WRKY33 相互協同地調控著擬南芥對熱激脅迫的響應[31]。

植物激素JA 參與了植物多個逆境脅迫的響應，能降低低溫脅迫對果實的傷害。香蕉MaWRKY26 基因被低溫脅迫和MeJA 誘導表達，并能增強香蕉果實的抗寒性。通過與基因啟動子的結合，MaWRKY26 還能反向激活JA 合成基因MaLOX2、MaAOS3 和MaOPR3 的表達，促進JA 的合成從而減輕低溫對香蕉果實造成的傷害[32]。茄子SmWRKY26 和SmWRKY32 基因在冷害脅迫下表達上調。通過VIGS 的方法，將這兩個基因沉默后，在冷害脅迫下，基因沉默的株系出現嚴重萎蔫，而對照僅呈現輕微的黃化，同時，基因沉默株系的葉片冷害指數（leaf chilling injury index，LCI）顯著高于對照[33]。

4.2 干旱脅迫

干旱是抑制植物生長和限制作物產量最嚴重的環境因素之一。擬南芥WRKY57 基因啟動子TDNA 插入的突變體adt 抗旱能力增強。與野生型擬南芥相比，adt 突變體和WRKY57 基因過量表達擬南芥植株內ABA 含量增加，同時，脅迫相關基因RD29A，ABA3 和NCED3 表達上調。WRKY57 通過調節ABA 的水平和正向調控脅迫相關基因的表達增強了擬南芥的耐旱性[34]。T-DNA 插入突變體abo3（Atwrky63）突變體擬南芥降低了對ABA 的敏感性和耐旱性，進一步的分析發現AtWRKY63 位于ABA 信號傳導途徑中ABI1、ABI2 和ABI5 的下游，ABF2、RD29A 和COR4 的上游，這說明AtWRKY63可通過調節ABA 的水平參與調控擬南芥的耐旱性[35]。水稻WRKY轉錄因子OsWRKY30 能與OsMPK3、OsMPK4、OsMPK7、OsMPK14、OsMPK20-4 和OsMPK 20-5 相互結合，并且能被OsMPK3、OsMPK7 和OsMPK14 磷酸化。OsWRKY30 基因的過量表現可顯著提高轉基因水稻的耐旱性。進一步的研究證明OsWRKY30 在 MAPKs 作用下的磷酸化是OsWRKY30 發揮生物學功能的關鍵[36]。

杜梨PbrWRKY53 基因被干旱和ABA 誘導大幅上調，但只受到鹽害和冷害輕微誘導。PbrWRKY53 基因過量表達的煙草和杜梨植株都增強了對干旱脅迫的耐受性。與對照相比，轉基因植株表現出更高的含水率、更少的活性氧含量、更高水平的抗氧化酶活性和代謝產物。此外，與野生型煙草相比，PbrWRKY53 基因在轉基因煙草中的過量表達使植株維生素C 含量增加。PbrWRKY53 基因被敲除的杜梨植株中，PbrNCED1 表達量下降，同時，植株對干旱脅迫的耐受性降低。酵母單雜交試驗、EMSA 和瞬時表達分析表明，PbrWRKY53 能與PbrNCED1 啟動子區的W-box 結合。PbrWRKY53轉錄因子通過調節PbrNCED1 的表達調控植株的耐旱性和維生素C 的合成[37]。玉米ZmWRKY40 基因的表達能被干旱、鹽害、高溫和ABA 所誘導，并且在干旱處理1 h 后即達峰值，為處理前表達量的12倍。對ZmWRKY40 基因過量表達的擬南芥分析發現，ZmWRKY40 通過調控脅迫相關基因STZ、DREB2B 和RD29A 表達，提高了POD（過氧化物歧化酶）和CAT（過氧化氫酶）的活性，降低了ROS（活性氧）的含量，從而增強了轉基因株系的抗旱性[38]。硬皮豆MuWRKY3 基因在干旱脅迫下極高表達。將MuWRKY3 基因轉入花生中進一步研究發現，與對照相比，轉基因株系在干旱脅迫處理后萎蔫癥狀較輕，并且癥狀出現得更晚。在干旱脅迫下，與脅迫相關的LEA、HSP、MIPS、APX、SOD 和CAT 基因在轉基因花生中表達上調，轉基因花生植株體內丙二醛、過氧化氫和超氧陰離子積累較少，游離脯氨酸、可溶性總糖含量和抗氧化酶活性較高[39]。

4.3 鹽害脅迫

鹽害脅迫不同程度地抑制了植物的營養生長和生殖生長，對植物造成原初鹽害和次生鹽害，破壞植物正常的形態結構，嚴重時植物甚至干枯死亡。擬南芥WRKY25 和WRKY33 基因的表達受NaCl 誘導上調，并且WRKY25 和WRKY33 基因的過量表達，能都增強轉基因植株對NaCl 的抗性[40]。葡萄VvWRKY30 基因的表達受鹽脅迫的誘導。將VvWRKY30 基因過量表達，鹽脅迫下的轉基因擬南芥株系中與抗氧化生物合成、糖代謝和脯氨酸生物合成相關的基因表達上調，同時具有較低的活性氧含量、較高的抗氧化活性、可溶性糖和脯氨酸濃度[41]。番茄SlWRKY8 基因的表達受番茄細菌性葉斑病病原（Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，Pst.DC3000）、干旱、鹽害、冷害、ABA、SA 的誘導上調。在鹽害脅迫下，SlWRKY8 基因過量表達的植株相較于對照植株僅表現輕微的萎蔫，同時，脯氨酸等滲透物質含量更高，脅迫應答基因SlAREB、SlDREB2A 和SlRD29 的表達上調[42]。酵母單雜交和瞬時共轉染試驗表明，苦蕎FtWRKY46 基因能與W-box 結合并激活報告基因的表達。在鹽害脅迫下，轉FtWRKY46 基因擬南芥的種子發芽率、根長、葉綠素含量、脯氨酸含量顯著高于對照，但MDA 含量顯著低于對照[43]。

4.4 其它非生物脅迫

利用擬南芥單突變體wrky54、wrky70，雙突變體wrky54wrky70 和WRKY70 過量表達的轉基因擬南芥進行滲透脅迫（聚乙二醇）研究發現，wrky54wrky70 雙突變體對滲透脅迫的耐受性明顯增強，同時，起滲透保護作用的脯氨酸積累減少，滲透脅迫反應基因的表達下調。滲透脅迫處理后，wrky54wrky70 雙突變體的失水率和氣孔導度比野生型要低。表明WRKY70 和WRKY54 共同作為氣孔關閉的負調節因子，影響了擬南芥的滲透脅迫耐受性[44]。在不同濃度低磷脅迫處理下，馬尾松PmWRKY11、PmWRKY12 和PmWRKY13 基因表達都上調[45]。過量表達OsWRKY74 基因顯著增強了水稻對磷饑餓（Pi starvation）的耐受性，而OsWRKY74基因下調的轉基因植株對磷饑餓敏感。在磷饑餓條件下，與野生型相比，過量表達OsWRKY74 基因的水稻植株根生物量、莖生物量、磷濃度、分蘗數、粒重不同程度地增加了，同時表現出更強的磷饑餓耐受性[46]。WRKY25 基因過量表達延長了轉基因擬南芥的生命周期，而敲除WRKY25 基因則加快了植株的衰老。與野生型擬南芥相比，WRKY25 基因過量表達植株表現出更低的H2O2含量和更強的氧化脅迫耐受性，wrky25 突變體的表現與WRKY25 基因過量表達植株恰恰相反[47]。

5 展望

WRKYs 是植物中最大的轉錄因子家族之一，參與了植物生物脅迫和非生物脅迫響應和植物生長發育的調控并發揮著關鍵的作用。近年來，對WRKY 在上述方面的研究取得了一定的進展，但是由于WRKY 家族成員眾多和參與調控的各種途徑相互交織，對WRKY轉錄因子家族各成員功能的冗余和差異，自我反饋調節機制和信號轉導途徑間的調控機理尚不清楚，仍需在深入持久研究的基礎上加以證實和完善。