小麥籽粒PPO活性檢測方法改良與應用

翟勝男，李豪圣，宋健民，劉愛峰，曹新有，程敦公， 趙振東，何中虎，夏先春，劉建軍

(1.山東省農業科學院作物研究所，山東濟南 250100；2.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081)

色澤是小麥面粉及面制品品質評價的重要指標[1-2]。小麥籽粒多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化酚類物質發生氧化還原反應產生醌類物質或催化多酚類變為氧合醌，后者發生自身非酶促聚合或與蛋白質氨基酸殘基或糖類發生反應，產生褐色或黑色的沉積物，是造成面粉及其制品酶促褐變的最主要原因[3-6]，可以解釋面粉及其制品加工儲藏過程中50%～70%的顏色褐變[7-8]。PPO不僅影響面制品表觀色澤，還影響食品特性及營養品質，因而倍受面粉加工企業和育種家的關注[9-10]。培育低籽粒PPO活性小麥品種，是對面制品色澤性狀進行改良的重要途徑，已成為小麥品質育種的重要目標。如何準確、快速、簡便地測定小麥籽粒PPO活性，是育種家們急需解決的問題。

利用分光光度法，以鄰苯二酚和L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA，L-dihydroxyphenylalanine)為底物，是目前測定小麥籽粒PPO活性最為常見的兩種方法[11-12]。Kruger等[7]和McCaig等[13]提出以鄰苯二酚為底物進行小麥籽粒PPO活性的測定，該方法大大提高了PPO活性檢測的精度和效率，操作簡便，費用低。Anderson和Morris[14]及Bettge[15]提出以L-DOPA為底物測定小麥籽粒PPO活性，進一步提高了小麥籽粒PPO活性檢測精度，該方法已被美國谷物化學協會(AACC，American Association for Cereal Chemistry)作為標準方法(AACC 22-85)，被廣泛應用。AACC分析方法第11版中，將其修訂為AACC 22-85.01[16]。

然而，分光光度法測定PPO活性的檢測通量很低，只能對樣本逐個進行檢測，操作繁瑣，測定時間長，工作量大，檢測效率低。酶標儀工作原理和分光光度計類似，且具有操作簡便、精度高、樣品微量、檢測效率高等優點，已被廣泛應用于三角褐指藻油脂含量、食用菌多糖含量、大豆總皂甙含量等的檢測[17-19]。

為了提高檢測效率和穩定性，為PPO活性高通量檢測和面制品色澤性狀遺傳改良提供技術支撐，本研究將酶標儀檢測技術應用于小麥面粉PPO活性測定，對傳統AACC 22-85.01法進行改良，并對改良方法的有效性進行了驗證，利用改良方法對283份國內外小麥品種進行PPO活性檢測，篩選籽粒PPO活性較低品種，為培育低籽粒PPO活性小麥品種的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

根據前人研究，選用26個籽粒PPO活性變異范圍較大的小麥品種，包括衡觀33、淮麥21、冀師02-1、蘭考906、臨麥2號、魯麥21、魯麥8號、洛旱2號、陜354、陜715、ProINTA Colibr 1、陜麥94、Aca 601、石新733、泰山1號、皖麥33、小偃22、小偃54、宿0663、煙農19、豫麥2號、鄭9023、中麥871、中育5號、周麥25和淄選2號，分別采用傳統AACC 22-85.01法[17]與改良方法測定PPO活性，用于驗證改良AACC 22-85.01法的準確性。選用144份我國黃淮麥區小麥品種，用于分析改良方法的重演性和穩定性。對283份具有代表性的國內外小麥品種用改良方法進行籽粒PPO活性檢測。根據生育期和春冬性不同，于2012—2013和2013—2014年度進行分區種植。其中，144份我國黃淮麥區小麥品種種植于河南安陽和安徽濉溪；42份北部冬麥區品種和48份國外品種種植于北京和河北石家莊；49份長江中下游麥區品種種植于安徽濉溪和四川成都。

所有供試材料采用隨機區組設計，3次重復，4行區，行長2 m，行距25 cm。試點均經過多年的科學管理和改善，土壤地力充裕，肥力均勻，田間管理同大田生產。對收獲籽粒進行磨粉，用于PPO活性測定。

1.2 制 粉

應用單籽粒谷物特性測試儀SKCS 4100(Perten，Sweden)測定籽粒硬度。利用近紅外分析儀Foss-Tecator 1241(Sweden)測定籽粒蛋白質含量和含水量。根據硬度等級計算潤麥所需加水量：軟質麥(硬度指數<40)為14%、混合麥(40<硬度指數<60)為15%、硬質麥(硬度指數>60)為16%。室溫潤麥16～18 h，應用Junior實驗磨(Branbender，Germany)制粉，出粉率約為60%。面粉4 ℃保存，用于PPO活性檢測。

1.3 PPO活性測定

分別利用傳統AACC 22-85.01法[17]與改良方法測定26個籽粒PPO活性變異范圍較大的小麥品種的籽粒PPO活性。

傳統AACC 22-85.01法[17]：5粒完整小麥種子置于2 mL離心管中；加入1.5 mL反應試劑[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)緩沖液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]；離心管放入往復振蕩器上，振蕩1 h，樣品充分暴露在空氣中；吸取1 mL反應液加入比色皿中，以L-DOPA/MOPS溶液作為對照，利用分光光度計測定反應液在475 nm下的吸光值。每個樣品重復2次，均值作為樣品PPO活性的表型值。如果兩個吸光值差異大于0.15，則進行第三次測定。

參照Mohammadi等[20]方法，對傳統AACC 22-85.01法[17]進行改良，具體步驟如下：

(1)稱取0.2 g面粉置于50 mL離心管中；

(2)加入1.5 mL反應試劑[50 mM MOPS(3-N-Morpholino propanesulfonic acid，pH 6.5)緩沖液配制的10 mM L-DOPA(L-3,4-dihydroxyphenyl alanine)]，迅速旋渦振蕩、混勻；

(3)將50 mL離心管放入往復振蕩器上，200 r·min-1、22 ℃振蕩30 min，樣品充分暴露在空氣中；

(4)將反應液迅速轉移至預先冷卻的2 mL離心管中，并插入冰中5 min終止反應；

(5)反應液在冷凍離心機中4 ℃ 5 000 r·min-1離心10 min；

(6)吸取200 μL上清液加入96孔酶標板(Costar 3590，USA)，以L-DOPA/MOPS溶液作為對照，利用酶標儀SpectraMax Plus 384(Molecular Devices，LLC，USA)測定上清液在475 nm下的吸光值，計算PPO活性值，單位為 U·g-1·min-1。

L-DOPA現配現用。應用改良方法測定283份國內外小麥品種籽粒PPO活性，每個樣品重復3次，均值作為樣品PPO活性的表型值。

1.4 統計分析

利用SAS V9.2(http://www.sas.com)軟件進行PPO活性基本數據分析，利用PROC CORR程序進行相關性分析，應用PROC GLM程序進行方差分析。利用Microsoft Excel軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 傳統AACC 22-85.01法與改良方法所測PPO活性比較

對兩種方法所測26個小麥品種籽粒PPO活性進行比較，結果如圖1所示，傳統方法所測PPO活性值較高，平均值為11.51 U·g-1·min-1，變化范圍為6.04 U·g-1·min-1～ 19.16 U·g-1·min-1，相對標準偏差為 0.03%～6.16%，變異系數為 32.3%。改良方法所測PPO活性值較低，平均值為5.63 U·g-1·min-1，變化范圍為3.35 U·g-1·min-1～8.80 U·g-1·min-1，相對標準偏差為0.11%～ 4.92%，變異系數為27.9%。兩種方法所測PPO活性呈極顯著正相關(R=0.982，P<0.001)。

圖1 兩種方法所測PPO活性的相關性Fig.1 Correlation of PPO activities measured by the two methods

由表1可知，重復對兩種方法的檢測結果均無顯著影響，說明試驗過程人為因素影響很小。品種對兩種方法所測小麥籽粒PPO活性值均有極顯著影響。

2.2 傳統AACC 22-85.01法與改良方法的差異性比較

如表2所示，與傳統AACC 22-85.01法相比，改良AACC 22-85.01法以面粉為試驗材料，反應時間縮短至30 min，應用96孔板和酶標儀代替比色皿和分光光度計，同時可檢測多個樣本，大大提高了檢測效率。

2.3 改良AACC 22-85.01法測定PPO活性穩定性分析

為了分析本研究改良AACC 22-85.01法測定PPO活性的穩定性和可靠性，應用此方法對144份我國黃淮麥區代表性小麥品種的PPO活性進行重復測定。結果如圖2所示，三次重復間PPO活性相關系數高達0.993～0.994，呈極顯著正相關(P<0.001)，表明改良AACC 22-85.01法測定PPO活性重復性好，穩定性高。

表1 兩種方法測定PPO活性的方差分析Table 1 Analyses of variance of PPO activities measured by the two methods

表2 兩種PPO活性測定方法比較Table 2 Comparison of the two methods for detecting PPO activity

圖2 改良AACC 22-85.01法測定PPO活性3次重復間的相關性Fig.2 Correlation of PPO activities between three replicates measured by the modified AACC 22-85.01 method

2.4 283份國內外小麥品種PPO活性分析

由表3可知，283份國內外小麥品種籽粒PPO活性變異范圍廣，遺傳基礎豐富。黃淮麥區小麥品種PPO活性為1.98 U·g-1·min-1～ 9.37 U·g-1·min-1，平均值為4.72 U·g-1·min-1；北部冬麥區小麥品種PPO活性為1.72 U·g-1·min-1～8.76 U·g-1·min-1，平均為4.34 U·g-1·min-1；長江中下游麥區小麥品種PPO活性為1.89 U·g-1·min-1～8.40 U·g-1·min-1，平均為3.86 U·g-1·min-1；國外小麥品種PPO活性為1.92 U·g-1·min-1～10.47 U·g-1·min-1，平均為5.85 U·g-1·min-1。

同一品種不同環境間PPO活性的相關系數為0.65～0.97。比較各個品種在不同環境下PPO活性值，發現在不同環境間穩定且PPO活性較低的品種34個(表4)，可作為培育低籽粒PPO活性小麥新品種的優異資源。

表3 283份小麥品種PPO活性Table 3 PPO activity of the 283 wheat varieties

表4 具有低PPO活性的小麥品種Table 4 Wheat varieties with low PPO activity

3 討 論

小麥籽粒PPO是造成面制品顏色褐變的最主要原因，培育低籽粒PPO活性品種已成為小麥品質改良的重要目標[21]。目前，對小麥PPO的研究主要集中在PPO活性與面制品色澤的關系[4,6,8]、QTL定位[22-24]、基因克隆及分子標記開發[25-27]等方面。準確、快速、穩定、簡便的PPO活性檢測方法是上述研究的基礎。

測定PPO活性的方法主要分為兩大類，耗氧電極法和分光光度法[15]。耗氧電極法主要是由于PPO催化反應需要消耗氧，溶液中氧濃度的減少速率與酶活力大小成正比，因而可以用單位時間內的耗氧量來表示PPO活性[12]。該方法精度極高但測定時要嚴格控制反應溫度。此外，新磨制的面粉由于脂肪氧化酶活性較強，其催化不飽和脂肪酸的過氧化反應也耗氧，對測定結果可能有一定影響。而分光光度法主要是測定單位時間內PPO催化酚類反應產物吸光度的變化來反映

PPO的活性[13,28]，可以用不同的化學試劑為底物進行PPO活性測試。AACC22-85.01法[17]以L-DOPA為底物，利用分光光度計測定小麥籽粒PPO活性，由于操作簡便、快速等特點被廣泛應用[12]。本研究對AACC 22-85.01法進行了改良，利用酶標儀檢測PPO活性，結果顯示，兩種方法測定的PPO活性呈極顯著正相關，且改良法所測PPO活性的相對標準偏差較小。用改良法重復測定144份小麥品種PPO活性，三次重復間相關系數高達0.993～0.994，表明該方法重復性好，穩定性高。此外，改良法應用96孔酶標板和酶標儀來測定PPO活性，無需更換清洗比色皿，大大減少工作量，同時可檢測多個樣本，縮短檢測時間，避免因測定時間過長而導致的誤差，檢測效率提高約12～15倍。因此，本研究改良的AACC 22-85.01法具有準確可靠、精密度高、重復性好、檢測效率高等優點，可以代替傳統方法用于小麥籽粒PPO活性的高通量檢測，為小麥品種資源篩選和面制品色澤改良提供技術支撐。

張 曉和田紀春[29]研究表明，面粉PPO活性與面制品色澤及色澤變化的相關性最大。因此，在低籽粒PPO活性小麥育種工作中，利用本研究改良的AACC 22-85.01法對高代育種材料面粉進行PPO活性測定和篩選，可更準確預測面制品顏色褐變程度，提高育種選擇的精準度。此外，本研究對283份國內外小麥品種籽粒PPO活性進行了檢測，結果表明，供試品種PPO活性變異范圍廣，遺傳基礎豐富。共篩選出在不同環境間PPO活性均較低且穩定的小麥品種34份，可作為低籽粒PPO活性小麥品種選育的重要親本 資源。