培養條件對草莓花粉萌發的影響

霍辰思，劉 偉，樊新萍，白牡丹，尚勇進

（1.山西農業大學果樹研究所，山西太原030031；2.園藝植物脫毒與繁育技術國家地方聯合工程研究中心，山西太谷030815）

草莓屬薔薇科多年生雌雄同株草本植物，自花結實率低，生產上一般采用人工授粉或蜜蜂授粉方式提高其坐果率和授粉率[1]。花粉質量的好壞主要是通過花粉活力進行評判，在果樹授粉前都會對其父本花粉進行生活力測定[2]。近幾年，隨著溫室大棚蓬勃發展，草莓種植業也快速提升。目前，我國種植的草莓品種基本上都是從美國以及日、韓等國家引進的外來品種，草莓親本遺傳背景狹窄，培育本土優良性狀草莓品種顯得尤為重要。迄今為止，常規雜交育種仍是我國品種選育的主要途徑[3]，掌握草莓不同品種花粉特性，是合理配置授粉植株、提高草莓坐果率的重要依據。

目前，對花粉活力的鑒定方法可歸納為染色劑法、電鏡形態觀察法、萌芽測定法、田間授粉法等[4]。其中，染色劑法根據染色液類別不同，又可分為I2-KI染色法、TTC染色法、MTT染色法、亞歷山大染色法、醋酸洋紅染色法和苯胺藍染色等；萌芽測定法包括離體萌發測定法和活體萌發測定法[5]。染色法雖然操作簡單，但由于染色液大部分為有毒試劑，且測定結果差異較大，僅適用于田間授粉快速檢測；而與染色法相比，花粉離體萌發試驗雖然操作復雜，但用該方法測定所得數據科學可靠，是目前雜交育種中花粉生活力測定的常用方法[6]。

本研究采用花粉離體萌發法測定草莓花粉的生活力（通過設計蔗糖濃度梯度為0、5%、10%、15%；硼酸濃度梯度為0、0.10%、0.15%，瓊脂濃度為4 g/L），對4個品種草莓花粉進行培養，旨在篩選出適合草莓花粉萌發的最優培養基，并進一步探討不同培養溫度和培養時間對花粉活力的影響，為今后草莓雜交授粉及新品種選育提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

選取香野、章姬、圣誕紅和紅顏4個草莓品種花粉為供試材料，其采自山西農業大學果樹研究所草莓大棚。于2020年4月23日至6月4日10：00左右采集大、中花蕾于紙袋中，晾置于溫度25℃陰涼通風室內；后用鑷子將健康花藥剝入硫酸紙折成的小盒，放入干燥器中；待花藥自然開裂散粉后，將其收入小瓶中，置于4℃冰箱中貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓花粉數量及畸形花粉率統計 收集草莓中花蕾期花朵，剝取完整健康花藥10～20枚，放入干燥的玻璃小瓶中，于干燥器中散粉，待花粉完全散出后，加入1 mL蒸餾水充分振蕩；用移液管吸取0.1 mL花粉水，用蒸餾水稀釋至10 mL，然后用移液槍吸取4μL花粉水滴于含凹槽載玻片上，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發情況，統計花粉粒總數及畸形花粉粒數，重復3次。采用花粉管離體萌發法測定花粉萌發率。

1.2.2 草莓花粉萌發最適培養基的篩選 通過設計蔗糖和硼酸不同濃度配比，配置硼酸濃度為0、0.10%、0.15%；蔗糖濃度為0、10%、15%；瓊脂濃度為4 g/L的固體培養基，每組濃度梯度重復6次。使用前可用微波爐將培養基加熱融化后，吸取100μL培養基于凹面載玻片上，待凝固后用解剖針挑取少量花粉均勻散播在培養基上；將載玻片放入鋪有濕紗布的培養皿中，將培養皿放到帶蓋的手術盤中，置于25℃恒溫培養箱暗培養5 h以上，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發情況，統計花粉萌發率。

1.2.3 草莓花粉萌發最佳時間的篩選 為進一步研究培養時間對花粉萌發的影響，試驗設置0、2、4、6、8、10 h時間梯度，用解剖針挑取適量花粉均勻散播在花粉萌發培養基（0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂）上，置于25℃恒溫培養箱暗培養，每次處理重復3次，在電子顯微鏡下觀察花粉萌發狀況，統計花粉萌發率。

1.2.4 草莓花粉萌發最佳溫度的篩選 試驗從低溫到高溫設置6個溫度梯度，分別為5、10、15、25、35、45℃。將花粉均勻撒播在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂培養基上，置于恒溫培養箱暗培養，每次處理重復3次；培養6～8 h后放到顯微鏡下觀察花粉萌發情況，并統計花粉萌發率。

1.3 數據分析

采用Excel 2003對試驗數據進行處理，計算平均值和標準偏差，繪制圖表；采用SPSS軟件進行單因素方差分析、Duncan多重比較，檢驗草莓不同品種花粉萌發率的差異（在α＝0.05/0.01水平上進行比較），6次重復。

2 結果與分析

2.1 花粉數量及畸形花粉率分析

從表1可以看出，香野、章姬、圣誕紅和紅顏每枚花藥中的花粉數量分別為20 267、26 467、25 133、10 933粒；正常花粉數分別為17 100、20 200、17 600、7 000粒；4個品種的畸形花粉率除章姬和圣誕紅差異不顯著，香野和紅顏差異極顯著，畸形花粉率從高到低依次為紅顏＞圣誕紅＞章姬＞香野，香野畸形花粉最少，畸形花粉率為15.74%，紅顏畸形花粉數最多，畸形花粉率為36.27%。

表1 不同草莓品種畸形花粉率分析

2.2 花粉最適培養基的篩選

從表2可以看出，4個品種花粉萌發率隨蔗糖和硼酸濃度的增加呈先升后降的趨勢；當培養基的蔗糖濃度為15%和硼酸濃度為0.10%時，花粉萌發率達到最高；其中，香野的花粉在此培養基萌發率最高，為87.55%，顯著高于紅顏花粉萌發率（72.38%）；圣誕紅、章姬花粉萌發率分別為83.05%、83.50%，二者差異不顯著；當培養基蔗糖濃度為15%不變、硼酸濃度上升為0.15%時，花粉萌發率有所下降，圣誕紅、章姬、香野和紅顏萌發率分別為74.87%、68.04%、77.82%和62.66%，其大小表現為香野＞圣誕紅＞章姬＞紅顏。因此，0.10%硼酸＋15%蔗糖＋ 4 g/L瓊脂為草莓花粉萌發的最適培養基。

表2 不同培養基類型的花粉萌發率分析 %

2.3 花粉萌發最佳時間的篩選

從表3可以看出，不同培養時間對草莓萌發率有一定的影響，在4～8 h時，隨時間上升4個草莓品種萌發率逐漸升高，在8 h萌發率達到最高；香野萌發率最高，在8 h花粉萌發率為88.54%；紅顏花粉萌發率最低，8 h花粉萌發率僅為52.14%，極顯著低于其他3個品種。當培養時間超過8 h時，4個品種的花粉萌發率均開始下降，而紅顏的花粉萌發率繼續增加，說明并不一定是培養時間越長花粉萌發率越高。因此，草莓花粉在0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂的培養基上培養8 h為花粉萌發的最佳時間。

表3 不同培養時間的花粉萌發率分析 %

2.4 花粉萌發最佳溫度的篩選

由表4可知，不同培養溫度對草莓萌發率有很大的影響，隨培養溫度升高4個草莓品種花粉萌發率呈先升高后下降的拋物線趨勢，在25℃培養8 h萌發率最高；其中，香野花粉萌發率最高，為87.50%，高于其他培養溫度；圣誕紅和章姬花粉萌發率分別為81.24%和82.49%，二者差異不顯著；紅顏萌發率最低，為66.53%。當溫度升高到45℃時，香野仍有少量花粉萌發，但萌發率僅為1.01%，其余3個品種幾乎未萌發，紅顏萌發率為0。因此，低溫和高溫均不利于草莓花粉萌發，25℃為4個品種花粉萌發的最適溫度。

表4 不同培養溫度的花粉萌發率分析 %

3 結論與討論

大量研究表明，花粉活力大小很大程度上受到花粉萌發率高低的制約，花粉萌發率越高，花粉活力越好，授粉后果實的坐果率、果實品質及雜交授粉成功率越高。草莓畸形果及雜交率低很大程度是由于花粉活力太差。不同植物花粉萌發所需培養條件各不相同，不僅受自身發育狀況的影響，也受培養基成分、溫度、培養時間等的影響[7]，當培養基蔗糖和硼酸濃度適宜時，花粉萌發率達到最高且利于花粉管伸長。蔗糖是花粉萌發和花粉管生長的營養來源，同時又為花粉代謝和跨膜運輸提供能量[8]。但過高的蔗糖濃度又會導致花粉萌發率降低甚至不萌發。曾祥久[9]對銀杏花粉培養基優化時發現，蔗糖質量濃度為50～100 g/L時，花粉萌發率最高；當質量濃度達到150～200 g/L時萌發率不升反降；宋艷榮[10]對蘋果花粉離體培養時發現，蔗糖濃度控制在5%～15%范圍內，有利于4種蘋果花粉的萌發；當蔗糖濃度大于10%時，則不利于其花粉萌發。本試驗結果發現，蔗糖濃度維持在10%～15%時最適草莓花粉萌發；當濃度超過15%時，萌發率降低。此外，花粉離體培養基離不開硼酸的作用，硼不僅是植物生長所需元素，也是花粉萌發不可或缺的元素，培養基如果缺少硼會導致花粉萌發過緩、花粉管生長緩慢甚至抑制其生長[11]。在花粉萌發過程中，硼酸能促進花粉對能源物質的吸收和利用，所以適宜濃度的硼酸也有利于花粉的萌發[12]。在本試驗中，硼酸濃度為0.10%時，4個草莓花粉萌發率達到最大值，其他濃度下其萌發率差異不顯著；當硼酸濃度超過0.15%時，花粉萌發率降低。也有研究表明，一定濃度的CaCl2對花粉萌發具有促進作用[13]。張瑞等[14]在對薄殼山核桃花粉研究時發現，Ca2+是花粉管極性生長不可缺少的物質，而花粉管尖端是Ca2+集中分布區域，外源給予一定濃度的鈣源能促進花粉管伸長。在今后的試驗中也可嘗試在培養基中加入適量的CaCl2，以達到花粉萌發的最佳效果。

此外，花粉活力也會受到溫度的影響，溫度與花粉活力呈負相關[15]。杜紀紅等[16]研究發現，一般花粉貯藏溫度越低壽命越長，當外界溫度升高時花粉內部呼吸強度變大，使其代謝旺盛、水分流失、營養物質耗損、酶活性減弱、產生有害次生代謝產物，這些都會加快花粉的衰老與死亡。龐夫花等[17]對草莓新品種寧玉的花粉特性研究發現，寧玉花粉在溫度達到45℃時仍有萌發，而紅顏在45℃時已不萌發。本研究中，只有香野草莓在45℃下有少量花粉萌發，萌發率僅為1.01%，其他3個品種幾乎未萌發；當溫度處于25℃時，4個品種草莓均達到最高萌發率，與王壯偉等[18]對豐香草莓花粉的研究結果一致。

不同品種花粉萌發時間也略有不同，草莓相對于桃、杏、李等薔薇科果樹花粉萌發慢，薛曉敏等[19]對李花粉萌發時間篩選發現，李花粉萌發快，2 h下花粉萌發即可滿足授粉需求；王壯偉等[18]研究發現，草莓花粉萌發高峰為3 h，3～5 h花粉萌發率趨于穩定；龐夫花等[17]將寧玉花粉培養8 h后花粉萌發率達到最高，隨著培養時間延長花粉萌發率逐漸下降。本試驗中，4個品種花粉萌發率隨著培養時間的延長呈先升后降的拋物線曲線，最強萌發時間為8 h。

本研究采用準確率較高的離體萌發法測定草莓花粉生活力，結果表明，4個草莓品種花粉萌發率最適的培養基為0.10%硼酸＋15%蔗糖＋4 g/L瓊脂，當培養基中蔗糖濃度為15%、硼酸濃度為0.10%～0.15%時花粉萌發率差異不顯著；花粉萌發最佳溫度為25℃，花粉萌發時間為8 h最適宜觀察統計。香野具有較強的花粉活力，花粉數量多、畸形花粉率低，這與實際生產上香野草莓果實個大、果實光澤強、果品質量高、畸形果率低等生理現象相符。香野草莓是一個比較容易栽培、經濟效益高的優良品種，在育種上可以考慮將其作為父本材料進行授粉，以提高雜交后代的品質和抗性。紅顏較其他3個品種花粉萌發率低，畸形花粉數也較多，這與龐夫花等[16]測定紅顏花粉萌發率的研究結果相似。盡管生產上紅顏草莓已成為國內草莓種植業栽培面積最大的品種，但是由于其抗病性較差，以其作為親本篩選抗病后代的概率較低。