EMS對(duì)工業(yè)大麻汾麻3號(hào)種子萌發(fā)的影響

馮旭平，康紅梅，趙銘森，高金虎，孟曉康，薛紅麗

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西汾陽032200）

大麻（Cannabis L.）是一種古老的經(jīng)濟(jì)作物，為大麻科大麻屬1年生草本植物，按用途可分為纖維用大麻、籽用大麻和藥用大麻[1]。大麻纖維具有抑菌、抗紫外線輻射、抗靜電等特性，可被應(yīng)用于紡織、造紙和汽車內(nèi)飾[2]。大麻籽中油脂和蛋白質(zhì)含量較高，可用來制作蛋白粉、大麻油等。其花葉含有的大麻二酚（CBD），是一種無精神活性的酚類物質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上具有減輕驚厥、炎癥、焦慮和嘔吐的作用，也可緩解腫瘤化療帶來的不適反應(yīng)，抑制癌細(xì)胞生長。目前，市面上已有的防治艾滋病、精神疾病等方面的藥物如屈大麻酚、大麻隆和Sativex等，它們中都含有CBD成分。另外，大麻植株中含有的酚類物質(zhì)及其衍生物，也可阻礙細(xì)菌等微生物代謝作用和生理活動(dòng)，因而，可被用于抗紫外線、抗氧化的護(hù)膚產(chǎn)品[3-5]。

大麻多樣化的用途促進(jìn)了大麻產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但大麻植株中含有一種叫四氫大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）的酚類物質(zhì)，它是一種精神活性物質(zhì)，屬于“毒品”管制的范疇，人體吸入后會(huì)出現(xiàn)幻覺、妄想、雙重人格等[6]。因此，大麻的栽培、種植、應(yīng)用受到嚴(yán)格的管制。國際上把THC含量小于0.3%的大麻稱為工業(yè)大麻，具有加工利用價(jià)值的工業(yè)大麻，必須在一定管制條件下可規(guī)模種植生產(chǎn)。目前，我國只有云南、黑龍江兩省制定了工業(yè)大麻種植、加工的地方法規(guī)，在這2個(gè)省的政府監(jiān)管下可進(jìn)行種植。其他省份只允許纖維、籽用工業(yè)大麻的種植。

我國現(xiàn)存的大麻種質(zhì)資源比較匱乏，如地方品種河南的固始麻、安徽的皖大麻等基本上是作為纖維麻來種植，不可或不適宜作籽用、藥用；同時(shí)由于地理因素的限制，不適宜在其他地方種植。因此，培育THC含量低（小于0.3%）的高油、高蛋白、高CBD專用型工業(yè)大麻新品種，豐富工業(yè)大麻遺傳種質(zhì)資源迫在眉睫。一般來說，通過物種的自然變異獲得新品種的速度慢、時(shí)間久、頻率小。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以通過人工手段加快物種的變異，如利用射線進(jìn)行輻射的物理誘變、利用化學(xué)藥劑進(jìn)行化學(xué)誘變、送入太空進(jìn)行太空輻射等，各種方法各有優(yōu)劣。其中，運(yùn)用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（Ethyle methanesulfonate，EMS）來進(jìn)行誘變是一種較為簡便、經(jīng)濟(jì)、易操作的誘變方法。EMS可以通過與DNA核苷酸中的堿基對(duì)作用使其結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)點(diǎn)突變[7-8]。此誘變方法對(duì)植物基因組的改變較小，類似于自然界的自發(fā)突變，對(duì)作物產(chǎn)生的不利影響較小，故經(jīng)常被人們用來進(jìn)行誘變育種。目前，EMS誘變育種已在西瓜、辣椒、黃瓜、水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、油菜、煙草等農(nóng)作物中廣泛被應(yīng)用[9-10]。EMS誘變具有兩面性，需要選擇合適的誘變條件來達(dá)到需要的誘變目的。

本試驗(yàn)以優(yōu)良工業(yè)大麻品種汾麻3號(hào)種子為材料，通過設(shè)置不同的EMS體積分?jǐn)?shù)和作用時(shí)間，調(diào)查統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率和芽長，來確定汾麻3號(hào)種子適宜的誘變條件，以期為下一步的工業(yè)大麻種質(zhì)資源創(chuàng)制、新品種的選育、突變體庫的構(gòu)建等提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試大麻品種為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所大麻課題組選育的籽用工業(yè)大麻新品種汾麻3號(hào)。該品種植株高大，分枝多，籽粒中等大小，油脂含量較高[11]，適合在山西大部分丘陵山坡地種植。

1.2 試劑

EMS原液購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。其他試劑購自太原飛達(dá)科貿(mào)公司，試劑標(biāo)準(zhǔn)為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018年冬季在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所（汾陽）所內(nèi)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。汾麻3號(hào)種子在室溫下被浸種16 h，再挑選出飽滿、成熟度好、未露白的種子進(jìn)行誘變處理。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)EMS體積分?jǐn)?shù)梯度，即0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%、2.5%、4.0%，2個(gè)誘變浸種時(shí)間（7.5、17.0 h），3次重復(fù)，共36個(gè)處理。每個(gè)處理50粒種子，放于15 mL的一次性離心管中進(jìn)行誘變處理。誘變處理時(shí)將36個(gè)處理的離心管置于緩慢振蕩的搖床上，使種子與誘變劑充分接觸。

各處理誘變結(jié)束后往離心管中加入適量1 mol/L硫代硫酸鈉溶液來終止誘變反應(yīng)，過程需10～20 min。取出誘變后的種子放置在流動(dòng)的自來水下沖洗2 h，從而徹底洗去藥物殘留。室溫下稍微晾干后，再將其裝入培養(yǎng)皿置于人工智能氣候箱中進(jìn)行紙上發(fā)芽培養(yǎng)。培養(yǎng)皿中濾紙需每天加水保持濕潤。人工智能氣候箱具體設(shè)置為：光級(jí)I級(jí)（約1 500 lx），光周期為12 h/12 h（光/暗），溫度為25℃/20℃（光/暗），相對(duì)濕度RH為70%。

每天觀察記錄各處理種子的發(fā)芽情況，并根據(jù)發(fā)芽率計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率。其中，各種子發(fā)芽以芽長度大于0.2 cm為標(biāo)準(zhǔn)，具體芽長用1 cm×1 cm方格紙進(jìn)行測量。基于培養(yǎng)到后期容易產(chǎn)生細(xì)菌污染以及芽壞死情況，把培養(yǎng)81 h后的發(fā)芽狀況作為本試驗(yàn)的最終發(fā)芽結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析；采用兩因素隨機(jī)區(qū)組進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘變體積分?jǐn)?shù)和誘變時(shí)間處理下汾麻3號(hào)種子的萌發(fā)動(dòng)態(tài)分析

通過觀察發(fā)現(xiàn)，處理終止后就已經(jīng)有少量種子露白萌動(dòng)。在人工智能氣候箱培養(yǎng)56 h后就已經(jīng)有大部分種子發(fā)芽，此時(shí)CK種子的平均發(fā)芽率已達(dá)91.45%，EMS體積分?jǐn)?shù)為2.5%的處理種子發(fā)芽率也達(dá)到45%，芽長達(dá)2.92 cm；培養(yǎng)81 h后CK與0.5%EMS體積分?jǐn)?shù)處理的種子發(fā)芽率都在90%以上，芽長分別為7.41、8.66 cm。從圖1可以看出，在相同的體積分?jǐn)?shù)與處理時(shí)間下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，種子發(fā)芽率增高，芽長變化規(guī)律則不一致，EMS體積分?jǐn)?shù)為2.5%和4.0%的處理，培養(yǎng)81 h時(shí)種子芽長高于培養(yǎng)56 h的；而EMS體積分?jǐn)?shù)為1.0%和1.5%處理，培養(yǎng)56 h的芽長則高于81 h的。這可能是由于EMS滲透進(jìn)入種子內(nèi)，參與或抑制其不同的發(fā)芽過程。另外也可能是每個(gè)種子對(duì)EMS的拮抗作用不同，因此，這種抑制不具有線性關(guān)系。

2.2 不同誘變體積分?jǐn)?shù)和誘變時(shí)間處理下汾麻3號(hào)種子的發(fā)芽情況分析

由表1可知，EMS體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，種子的發(fā)芽率與對(duì)照相差不大，處理時(shí)間7.5 h時(shí)發(fā)芽率為99.00%（相應(yīng)的CK為93.00%），處理時(shí)間17.0 h時(shí)，發(fā)芽率為96.02%（相應(yīng)的CK為98.00%）。隨著EMS體積分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)芽率逐漸降低；在EMS低體積分?jǐn)?shù)（0.5%、1.0%、1.5%）時(shí)，發(fā)芽率分別為99.00%、93.00%、91.00%（處理7.5 h）和96.02%、89.96%、84.00%（處理17.0 h），降幅比較小；在高體積分?jǐn)?shù)（2.5%、4.0%）時(shí)，發(fā)芽率分別是72.36%、61.00%（處理7.5 h）和41.00%、3.00%（處理17.0 h），后者降幅較大。方差分析結(jié)果表明（表2），不同體積分?jǐn)?shù)、處理時(shí)間，以及二者互作之間差異極顯著，P值分別為0.000、0.000、0.001。其中，不同EMS體積分?jǐn)?shù)處理的種子發(fā)芽率從大到小排序?yàn)?.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，0（CK）、0.5%、1.0%、1.5%之間差異不顯著，它們與2.5%、4.0%之間差異顯著，2.5%與4.0%之間差異也顯著。

表1 不同EMS體積分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間對(duì)汾麻3號(hào)種子萌發(fā)的影響

表2 不同EMS體積分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間下種子發(fā)芽率的方差分析

芽長的變化規(guī)律也類似。由表1可知，隨著EMS體積分?jǐn)?shù)的增加，芽長逐漸變小，EMS體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，2種處理時(shí)間下種子的平均芽長在8.66 cm，在EMS體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)，芽長為6.13 cm，EMS體積分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，芽長為5.11 cm，在高體積分?jǐn)?shù)2.5%和4.0%時(shí)，芽長分別縮短到3.84、2.09 cm。說明EMS體積分?jǐn)?shù)越高越抑制種子胚芽的生長。在不同處理時(shí)間下，EMS體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，芽長分別是9.28 cm（7.5 h）和8.05 cm（17.0 h），二者相差1.23 cm；在EMS體積分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，芽長分別是5.31 cm（7.5 h）和2.37 cm（17.0 h），二者相差2.94 cm。由此可見，處理時(shí)間增加芽長減小，且低體積分?jǐn)?shù)時(shí)減小幅度小，高體積分?jǐn)?shù)時(shí)減小幅度大。方差分析結(jié)果表明（表3），EMS體積分?jǐn)?shù)之間差異極顯著（P＝0.000），處理時(shí)間以及二者互作之間差異不顯著（P＞0.05）。其中，不同EMS體積分?jǐn)?shù)處理的種子芽長從長到短排序?yàn)?.5%＞0（CK）＞1.0%＞1.5%＞2.5%＞4.0%。其中，低體積分?jǐn)?shù)0、0.5%、1.0%、1.5%之間差異不顯著，但它們與2.5%、4.0%之間差異顯著，另外，高體積分?jǐn)?shù)2.5%與4.0%之間差異也顯著。

總的來說，在同一處理時(shí)間下，隨著EMS體積分?jǐn)?shù)的增加，發(fā)芽率降低；在同一體積分?jǐn)?shù)下，隨著處理時(shí)間的增加，發(fā)芽率降低。芽長變化規(guī)律也類似，隨著EMS體積分?jǐn)?shù)的增加，芽長縮短，處理時(shí)間長的種子芽長降幅更大。

表3 不同EMS體積分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間下種子芽長的方差分析

2.3 EMS誘變適宜體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間條件分析

本試驗(yàn)中，汾麻3號(hào)種子在較低體積分?jǐn)?shù)（0～1.5%）時(shí)，發(fā)芽率相對(duì)較高（91%～99%）；在高體積分?jǐn)?shù)（2.5%～4.0%）時(shí)，發(fā)芽率則降低。從圖2可以看出，隨著EMS體積分?jǐn)?shù)的增加，種子數(shù)量越來越少，芽長也減小。隨著處理時(shí)間從7.5 h增加到17.0 h，種子數(shù)量也明顯減少，即發(fā)芽率減小，芽長變短。考慮到大麻種子適宜的播種深度為2～3 cm，芽太短不利于出苗，建議EMS體積分?jǐn)?shù)為2.5%、處理時(shí)間為7.5 h可以作為相對(duì)適宜的誘變條件。

3 結(jié)論與討論

EMS應(yīng)用于許多作物的誘變育種中。陳煜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，陸地棉魯6269的出苗率為49%的誘變條件是1.0%的EMS處理10 h。陳喜明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.8%的EMS處理8 h是蕓豆種子的最佳誘變條件。安佰義等[14]利用EMS誘變白樺種子，發(fā)現(xiàn)EMS顯著抑制種子的發(fā)芽率以及發(fā)芽起始時(shí)間。姜穎[15]研究發(fā)現(xiàn)，EMS誘變大麻品種火麻1號(hào)種子的適宜濃度為1.5%，處理時(shí)間為8 h，格里昂為1.5%濃度和6 h的處理時(shí)間；金刀15為1.5%濃度和8 h的處理時(shí)間。其研究還發(fā)現(xiàn)，EMS對(duì)胚根、胚軸的生長有抑制作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，高體積分?jǐn)?shù)的EMS顯著降低汾麻3號(hào)種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率以及芽長，并且抑制種子的萌發(fā)與芽的生長。但是，本研究得出的汾麻3號(hào)種子最適誘變條件為：EMS體積分?jǐn)?shù)2.5%、處理時(shí)間7.5 h。與前人研究結(jié)果比，EMS體積分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，處理時(shí)間較少。這在其他作物上也有類似的研究結(jié)果。如楊楠等[16]研究發(fā)現(xiàn)，6%的EMS溶液處理12、24 h可作為誘導(dǎo)知母種子建立突變體庫的適宜條件。其研究結(jié)果中，EMS濃度高達(dá)6%。這可能與品種、種子類型以及誘變所用的緩沖液、誘變處理時(shí)的溫度和種子前處理等有關(guān)，也可能與EMS溶液濃度與處理時(shí)間的互作效應(yīng)有關(guān)。關(guān)于EMS體積分?jǐn)?shù)與誘變時(shí)間的互作效應(yīng)，前人也有發(fā)現(xiàn)。程蛟文等[17]研究發(fā)現(xiàn)，EMS溶液濃度、誘變時(shí)間以及二者交互作用均對(duì)苦瓜種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率具有顯著影響，其半致死條件為：先清水浸種8 h，用1.5%或1.2%處理2 h。姚恒等[18]通過用不同體積分?jǐn)?shù)與不同處理時(shí)間誘變烤煙K326種子，得出EMS體積分?jǐn)?shù)1.15%處理12 h或者0.88%處理16 h，或者0.7%體積分?jǐn)?shù)處理12 h或者1.1%體積分?jǐn)?shù)處理8 h都是該品種的半致死條件。

明確EMS誘變適宜條件是開展EMS誘變育種研究的前提。EMS在大麻上的誘變只有少數(shù)人進(jìn)行過研究。考慮到品種與地域的特異性，有必要重新研究篩選確定特定品種的適宜誘變條件，為相關(guān)人員開展下一步的誘變育種提供參考。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，較低體積分?jǐn)?shù)（0.5%）的EMS可刺激大麻種子的萌發(fā)，使其發(fā)芽率、芽長高于對(duì)照。另外在本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，同一濃度下誘變時(shí)間長的發(fā)芽率以及芽長高于或大于誘變時(shí)間短的情況，可能是由于試驗(yàn)中運(yùn)用硫代硫酸鈉終止反應(yīng)以及清水清洗藥劑不夠徹底，導(dǎo)致藥物有少量殘留所致或者與誘變處理時(shí)種子與溶液未充分接觸有關(guān)或者是EMS誘變劑對(duì)該種子的誘變作用并不是表現(xiàn)在抑制芽長方面。

隨著市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，工業(yè)大麻作為一種特殊的經(jīng)濟(jì)作物，其基礎(chǔ)研究和多功能利用越來越受到重視。種質(zhì)資源是開展各類研究應(yīng)用的首要前提，國外的高CBD品種，CBD含量能達(dá)到20%且THC又符合國際標(biāo)準(zhǔn)（≤0.3%）。目前，國內(nèi)的資源大都是纖維用或籽用，可提取利用大麻酚類物質(zhì)CBD、CBG、THC等方面的種質(zhì)資源相對(duì)欠缺，如作為在云南大規(guī)模種植的藥用品種云麻8號(hào)，CBD含量也未超過2%，而其他省份更未有這方面資源。利用各種手段如EMS誘變等構(gòu)建其突變體庫并結(jié)合基因測序等手段，可以快速確定變異基因明確其功能，從而更快速高效地選育出市場需求的各種特性的專用型品種。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，工業(yè)大麻汾麻3號(hào)適宜的EMS誘變條件是：2.5%EMS體積分?jǐn)?shù)和7.5 h處理時(shí)間。