流行性腹瀉病毒分子生物學研究進展

（溫氏食品集團股份有限公司/國家生豬種業工程技術研究中心，廣東云浮 527400）

1971年，豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）在英國被首次發現，隨后迅速傳至西班牙等其他歐洲國家[1]；1982年，日本發現PED，隨后在中國、韓國等亞洲國家相繼有PED流行的報道[2]；2010年，我國暴發PED，該病的廣泛傳播給我國乃至世界養豬行業造成巨大的經濟損失[3]；2013年，美國首次暴發PED，經分析發現該毒株與中國分離的AH2012毒株同源性高達97%～99%。如今，PED已經成為一種世界范圍內的流行病。感染豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的哺乳仔豬及保育豬死亡率極高，因此研究PEDV的病原學、病毒基因組特性、感染機制等，為預防PED以及疫苗研發提供新的思路與參考。

1 病原學

1.1 病毒粒子形態結構

PEDV為尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronaviridae）成員[4]。PEDV有囊膜，囊膜表面有18～23 nm纖突，呈花瓣狀，由核心向四周呈放射狀分布，纖突末端呈球狀；該病毒直徑約為95～190 nm，為單股正鏈、不分節段RNA病毒。PEDV基因組大小約為28 kb，編碼7個開放閱讀框 （ORF1a，ORF1b，ORF2～6）[5]。ORF1a、ORF1b編碼病毒聚合酶，ORF3編碼非結構蛋白并且可能與PEDV致病性相關；ORF2、ORF4～6分別編碼病毒纖突糖蛋白（S，150～220 kDa）、次要嵌合蛋白（M，20～30 kDa）、主要嵌膜蛋白（E，7 kDa）以及核衣殼蛋白（N，58 kDa），PEDV整個基因組的編碼順序為：5’UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR[6，7]。

1.2 基因型

由于冠狀病毒RNA酶缺乏校正活性，因此病毒在復制的過程中不能保證基因組的保真性，從而導致了病毒遺傳具有多樣性。目前，常以PEDV的S或S1基因（1～735 aa）進行血清分型或基因分型。目前已知的PEDV僅有1個血清型，但是根據S基因可以將PEDV分為2個基因型，分別為：1型基因群（G1，主要為經典型）以及2型基因群（G2，主要是野毒株或暴發流行毒株）；每種基因群中均可分為2個亞型，分別為G1a與G1b亞型，G2a與G2b亞型。G1基因群G1a亞型包括經典的毒株，如疫苗毒株CV777等已經適應細胞生長的毒株；G1b亞型包含中國、美國、韓國、歐洲近期的變異分離毒株。G2基因群包含全球的野毒株，細分為G2a與G2b亞型，主要是亞洲當前毒株或北美及亞洲大暴發流行毒株；G2b亞型毒株可能是由G1a毒株亞型毒力位點突變引起的[8]。

與CV777毒株相比較，PEDV G2毒株的S蛋白在N端高變區存在氨基酸的插入和缺失（55～56氨基酸位點、135～136氨基酸位點分別插入4個氨基酸以及1個氨基酸，160～161氨基酸中缺失2個氨基酸）。除此之外，韓國、中國等流行毒株（MF3809與FL2013）為G2毒株S蛋白基因突變產生的新毒株[9]。

G1b毒株是從流行的毒株中分離出來的，但新型的G1b變異毒株在分子遺傳學上與G1a毒株、G2毒株顯著不同，G1b毒株不包含G2野毒株S基因發生變異的典型特征。以S蛋白三分之一N末端基因進行基因進化樹分析顯示，G1b毒株與G1a經典毒株的同源性為95%，與G2流行毒株的同源性低于89%。對于PEDV S基因其他部分進行分析表明G1b毒株與G2野毒株的同源性超過99%；PEDV全基因組進化分析結果表明G1b亞型毒株與G2流行野毒株親緣性相近[10]。

2 PEDV編碼蛋白及其生物學功能

PEDV基因組編碼7個開放閱讀框，ORF1a與ORF1b編碼12個非結構蛋白（Nsp1～7，9～13），主要參與病毒的復制過程；ORF2、ORF4～6分別編碼4個結構蛋白（S，M，E，N），主要與病毒的抗原表位有關或病毒表面結構蛋白或核衣殼蛋白相關[7]；ORF3編碼非結構蛋白，是PEDV唯一的輔助因子，可能與病毒的毒力有關，但其具體功能尚不清楚。

2.1 結構蛋白

2.1.1 纖突蛋白S（S蛋白）

S蛋白由1 383個氨基酸組成，屬于Ⅰ型糖蛋白，大小約180～200 kDa，是病毒粒子表面的糖基化纖突蛋白，含有病毒粒子的主要抗原表位。S蛋白包含4個部分，分別為信號肽區（1～18 aa）、4個中和表位（499～638 aa、748～755 aa、764～771 aa以及 1 368～1 374 aa）、1個跨膜結構域 （1 334～1 356 aa）以及1個短的胞漿區（1 357～1 383 aa）。S蛋白是PEDV的主要表面抗原，在調節宿主細胞受體蛋白與病毒的相互作用中起著重要的作用，并能介導病毒進入宿主細胞，最為重要的是可刺激宿主產生中和抗體。因此，S蛋白可以作為疫苗和抗病毒藥物開發的靶點[11]。

S蛋白主要以三聚體的形式錨定在病毒粒子表面，并且通過S1（1～789 aa）結構域和S2（790～1383 aa）結構域介導細胞黏附及膜融合。當宿主細胞膜受體與病毒粒子S1受體結合位點結合后，經一系列的細胞反應，激活信號肽上酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。S1區域內包含著PEDV的主要抗原表位，S1蛋白C末端結構域（CTD）與宿主細胞膜上的氨肽酶N（APN）相互作用誘導中和抗體產生[12]。但也有研究者使用PEDV S1結構域內的N末端區域（NTD231-501）利用大腸桿菌表達出PEDV S蛋白的N末端區，經動物實驗證明，口服的蛋白可與小腸上皮細胞中的M細胞特異性結合，可誘導分泌產生高滴度的特異性抗體IgA，表明該區域可以作為疫苗作用的候選區域，為疫苗的研發提供新的思路[13]。通過對各種冠狀病毒的S序列進行分析發現，S2序列較S1序列更加保守，S2為膜融合的亞單位，包括HR1和HR2兩部分，研究發現HR1與HR2相互作用的肽段可以抑制病毒進入細胞[14]。

2.1.2 糖基化膜蛋白（M蛋白）

M蛋白長度為681 bp（編碼226個氨基酸），是病毒粒子包膜最為豐富的蛋白，在病毒裝配以及出芽的過程中起到重要作用。M蛋白基因較為保守，可以將其作為分子生物學診斷的靶基因。M蛋白具有3個跨膜結構，在病毒的外部帶有短的氨基末端結構域，在病毒的內部含有較長的羧基末端結構域[15]。糖基化膜蛋白可用于 PED 血清學診斷[16，17]。

2.1.3 核衣殼蛋白（N蛋白）

N蛋白長度為1 326 bp（編碼442個氨基酸），分子量約55～58 kDa，存在6～7個潛在的磷酸化位點，主要組成PEDV的衣殼蛋白。N蛋白具有高度的保守性，分為3個保守的結構域：C端結構域、中間結構域、N端結構域，其與基因組RNA形成RNP復合體并且參與病毒的復制和轉錄[18]。N蛋白是全基因組中的相關磷酸化蛋白，其抗原決定簇是誘導機體免疫的重要組成成分，可誘導強烈的細胞免疫反應[19]；N蛋白免疫機體后可引起系統免疫和黏膜免疫，可作為免疫增強劑或分子佐劑[20]。

N蛋白可以通過封閉NF-κB通路，抑制IFN-β及IFN-λ的產生，誘導細胞凋亡[21]。PEDV N蛋白通過延長細胞周期的S期從而抑制腸上皮細胞的生長，刺激上皮細胞高水平表達IL-8，促進炎癥反應[22]。

2.1.4 小糖膜蛋白（E蛋白）

E蛋白長度為231 bp，編碼76個氨基酸，是PEDV病毒粒子中最小的結構蛋白，主要定位在內質網內。E蛋白能夠引起內質網應激和NF-κB的激活，能上調IL-8和Bcl-2的表達[23]，主要在病毒的復制和出芽過程中起重要作用。

2.2 非結構蛋白

ORF3是由224個氨基酸組成的非結構蛋白，是PEDV中唯一的輔助性蛋白，重量約25 kDa。ORF3能夠編碼一種具鉀離子活性的通道蛋白，同時通過影響病毒向細胞外的釋放而調節病毒的繁殖[24]。ORF3與PEDV細胞適應性及病毒毒力相關，改變ORF3基因可以提高PEDV在體外細胞內的適應性并且減弱病毒的毒力，ORF3可以作為PEDV適應細胞培養并且毒力減弱的標志[25]。研究人員利用反向遺傳手段構建出含有不同毒株ORF3的感染性克隆，結果顯示含有完整的ORF3蛋白抑制病毒在細胞中復制，而將ORF3基因截短或者對ORF3基因進行點突變可以緩解這種效應；研究還發現ORF3基因中L81區域在構建感染性克隆中拯救PEDV中發揮重要的作用，同時該區域在病毒感染宿主起關鍵性作用[26]。

PEDV復制酶編碼序列占病毒全基因組的2/3，由ORF1a和ORF1b 2個開放閱讀框組成，2個開放閱讀框之間有46 nt的重疊區域，重疊區域中存在1個滑動序列和1個假節結構。該假節結構能引起滑動序列發生-1位核糖體移碼翻譯，最終形成2個多聚蛋白（PP1a和PP1ab）。PP1a和 PP1ab被內部蛋白酶水解成Nsp1α、Nsp1β和Nsp2～12，最終加工成為16個非結構蛋白（Nsp1～Nsp16）。PP1ab在病毒感染早期發揮重要作用，主要是對負鏈RNA、前導RNA、亞基因組RNA和子代病毒RNA進行轉錄，并切割多聚蛋白產生功能性蛋白[3，27-29]。

3 PEDV感染宿主機制

冠狀病毒有廣泛的宿主（主要為哺乳動物），如人類、蝙蝠、鯨魚以及鳥類等，但是每一種病毒限定在特定的宿主范圍或者是只感染自然宿主。此外，冠狀病毒對呼吸道以及腸道上皮細胞、巨噬細胞有明顯的趨向性。

3.1 PEDV感染細胞機制

PEDV的感染具有組織受限性，病毒只在天然宿主的小腸絨毛上皮細胞或腸細胞中復制增殖。豬小腸上皮細胞表面表達的PEDV細胞受體——豬氨肽酶N（pAPN）。PEDV S蛋白的S1結構域是識別pAPN受體的表位，兩者通過直接膜融合將病毒轉運至靶細胞，病毒脫殼后將核酸釋放至細胞質中[12，30，31]。PEDV除了在天然宿主的原代靶細胞中可以進行培養外，還可以使用Vero和 MARC-145細胞進行體外培養[32，33]。在使用Vero細胞系分離PEDV時，使用胰酶預處理，將S蛋白分割成S1與S2 2個亞基，促進PEDV與細胞相結合，確保將病毒的核酸釋放至細胞內，從而保證病毒的復制以及體外繁殖擴增。然而，一些細胞減毒PEDV毒株（SM98-1毒株和83P-5毒株）可以在不使用胰蛋白酶預處理的情況下在細胞系中繁殖[30，34-36]。

由于病毒只能在細胞中擴增繁殖，其可調節細胞因子或者信號傳導途徑，以便病毒本身適應在宿主細胞中的自身繁殖。蛋白組學分析顯示PEDV感染Vero細胞參與的細胞凋亡，信號轉導和應激反應信號通路蛋白的表達均受到影響。PEDV通過不依賴半胱天冬酶的線粒體凋亡誘導因子（AIF）途徑在體內或體外誘導細胞凋亡。PEDV通過激活3種主要的促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯反應感染細胞，主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）以及c-Jun N末端激酶（JNK）[37，38]。此外，PEDV還可以誘導ER應激并激活NF-κB途徑。PEDV感染宿主細胞并參與復制的過程依賴于多細胞內的過程，體外感染PEDV細胞外的刺激會出現如細胞凋亡、MAPK信號傳導以及ER應激等信號通路[22，23]。

3.2 PEDV致病機制

絕大多數研究認為PEDV經消化道系統感染宿主，并主要集中在小腸絨毛上皮細胞中進行增殖，感染后的豬腸道上皮細胞死亡致使絨毛縮短、絨毛上皮細胞消化吸收功能下降，最終引起豬只出現腹瀉、嘔吐、厭食等臨床癥狀，持續時間大約1個星期。病毒感染小腸絨毛頂端和兩側的上皮細胞導致細胞凋亡，腸道上皮絨毛變短、腸道萎縮，導致腹瀉。由于仔豬腸道的細胞較成年豬只腸道細胞更新較慢，因此PEDV感染后，仔豬腸道細胞（更新約1周左右）出現大量死亡后呈現透明癥狀，致使仔豬無法吸收營養物質而出現腹瀉、嘔吐等現象而死亡；成年豬只腸道細胞（更新為1～2 d）更新較快，在壞死的腸道上皮細胞脫落后，會有細胞補充，出現一過性的嘔吐、腹瀉、厭食等癥狀一過性的感染，病死率較低。感染PEDV的仔豬可以通過RT-PCR和IHC技術在肺臟、肝臟、腎臟以及脾臟中檢測到[39]。

近期研究表明，PEDV也可以通過呼吸道感染宿主，空氣中的PEDV病毒進入鼻腔，在鼻上皮細胞中積累并傳播。樹突狀細胞（DC）作為抗原遞呈細胞，可能在病毒進入鼻粘膜并轉移至CD3+T細胞中起作用。攜帶病毒的T細胞通過淋巴細胞再循環進入血液并到達腸道，引起典型的豬流行性腹瀉癥狀[40]。

4 展望

在過去的20～30年里，PEDV已經給養豬產業造成了一定的困擾。2013年北美發現PEDV后，蔓延至整個美洲大陸，此后多個國家和地區均有PED病例的相關報道。盡管研究學者已經在病原學、免疫學、流行病學以及疫苗免疫學取得一定成就，但是大部分研究是在PEDV傳播至北美后開始的。

PEDV暴發以來，危害程度愈演愈烈，其主要原因是沒有有效的疫苗與藥物。目前，PEDV的致病機理尚未明朗，嚴重阻礙了有效藥物的研發，臨床上絕大部分使用經典毒株CV777疫苗免疫豬群，但效果一般；部分生產工作者使用自家組織滅活苗或者返飼等方法進行本場豬群的免疫接種，采集母豬乳汁檢測發現可產生較高滴度的IgA，可有效保護仔豬免于感染PEDV。因此，PEDV免疫接種的關鍵在于毒株，免疫接種時了解當地的流行毒株，選擇適當的疫苗株進行免疫接種。

根據國內外的研究進展，PEDV有以下幾個方面研究亟待加強：①加強PEDV流行病學調查，分離新毒株并進行基因組學與蛋白組學研究；②加強PEDV病毒分離方法及技術研究，部分專家提出PEDV的基因組可能與病毒的分離密切相關，因此可將基因組學應用至PEDV分離方法研究中；③加強PEDV感染細胞機制的研究，深入研究病毒融合細胞機制，探討結構蛋白與非結構蛋白在細胞融合中發揮的具體作用；④加強PEDV感染宿主后介導的宿主免疫應答機制的相關研究，探討PEDV在宿主體內產生的免疫相關研究，闡明宿主抗病毒機制以及PEDV免疫逃逸機制；⑤加強新型疫苗研究，利用新型載體尤其是黏膜免疫相關載體進行研究，充分發揮黏膜免疫相關功能；⑥加強PEDV相關結構域的功能，如S1 N端或C端結構域誘導產生的的免疫反應等。