PCV2免疫調(diào)節(jié)及遺傳變異研究進展

湯智慧，楊 柯，王翠華

(1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.漢中市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西 漢中 723102)

1991年在加拿大北部出現(xiàn)由豬圓環(huán)病毒感染而流行的疾病，被命名為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningpigsmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)。2004年至2005年初，魁北克的病例急劇增多并在其他地區(qū)出現(xiàn)蔓延，主要臨床癥狀有呼吸困難、消瘦、腹瀉、體表淋巴結(jié)腫大、黃疸等癥狀[1]，另外還伴有發(fā)熱、咳嗽、胃炎、神經(jīng)癥狀，有時導(dǎo)致突然死亡，嚴重流行時可增加斷奶仔豬的死亡率[2]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)為單鏈環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，全基因組大小1.7kb左右。目前PCV包括3個血清型，PCV1、PCV2和PCV3[3]。其中ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep和Rep')，ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)，ORF3和ORF4編碼參與細胞凋亡和抗凋亡的蛋白[4]。衣殼基因(Cap)是系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最廣泛的基因，應(yīng)用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法將PCV2序列分為5個基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[5]。PCV2的特點是突變率高，易出現(xiàn)基因型優(yōu)勢轉(zhuǎn)移，研究表明疫苗接種可能對其進化產(chǎn)生一定影響[6]。

在受感染豬體的淋巴組織中可以觀察到巨噬細胞/單核細胞的數(shù)量增多，血液和免疫器官中B細胞和T細胞數(shù)量減少，并且產(chǎn)生廣泛的病變。PCV2是引發(fā)PMWS的重要病因，在世界多地均具有較高的感染率，大多數(shù)豬群為亞臨床感染，只有一部分動物表現(xiàn)出顯性感染[7]。自2007年以來，一些商業(yè)疫苗的使用大大減少了PCV2感染造成的經(jīng)濟損失。但是盡管接種了疫苗，病毒仍然在豬群中傳播蔓延。

一般情況下，機體對病原體的免疫反應(yīng)可以清除病原體并產(chǎn)生免疫記憶。而病毒在進化過程中通過一系列機制來規(guī)避甚至利用機體免疫系統(tǒng)來完成它們的生命周期。如PCV2能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在，導(dǎo)致機體處于長期的促炎狀態(tài)，并引起相關(guān)免疫病理反應(yīng)。PCV2感染的結(jié)果在不同個體之間又有很大的差異。受PMWS影響，豬體出現(xiàn)嚴重的淋巴細胞耗竭，從而引起免疫抑制[8]。近年來，關(guān)于免疫系統(tǒng)參與發(fā)病機制的研究越來越多，PCV2在進化過程中用于逃避免疫防御的機制也越來越多。

1 PCV2感染后的免疫特性

1.1 細胞因子對PCV2感染的免疫調(diào)節(jié)

非特異性免疫應(yīng)答是抵御病原體感染的早期屏障，這種反應(yīng)在病原體侵入后立即被激活。早期反應(yīng)不能清除病原體，就會引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。在防御PCV2入侵過程中，樹突狀細胞(DCs)起著重要的作用。DCs和巨噬細胞是首先對抗病原體的免疫細胞，它們通過吞噬作用吞噬病原體，并將抗原提呈給T淋巴細胞啟動特異性免疫應(yīng)答，在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生I型干擾素(IFN)[9]。起到抗原提呈作用的樹突狀細胞分為兩類:傳統(tǒng)樹突狀細胞(cDC)和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)。PCV2能夠調(diào)節(jié)DC的活性，病毒被DC吞噬，但并不會在這些細胞中活躍地復(fù)制，不影響它們的生存[10]。研究表明，PCV2的存在不會影響傳統(tǒng)樹突狀細胞(cDC)的功能，但會影響漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)[11]。在病毒的刺激下pDC產(chǎn)生IFN-α，從而產(chǎn)生抗病毒作用。然而，在體外培養(yǎng)的pDCs/單核細胞顯示，PCV2可抑制IFN-α的分泌，即使存在IFN-α刺激劑的情況下這種抑制作用仍然存在。而體內(nèi)感染PCV2反而可以誘導(dǎo)IFN-α的分泌[12]。所以PCV2可以同時具有免疫刺激(體內(nèi)感染)和免疫抑制作用(體外培養(yǎng))。研究表明：一方面，病毒可能通過抑制/刺激CpG基序與細胞內(nèi)胞質(zhì)或內(nèi)體受體相互作用來調(diào)節(jié)細胞因子[13]；另一方面，PCV2封閉的基因組ssDNA(促進作用)和游離dsDNA(抑制作用)復(fù)制形式之間的平衡決定了PCV2感染的免疫調(diào)節(jié)特性[14]。

在免疫調(diào)節(jié)過程中，另一種起到重要調(diào)節(jié)作用的細胞因子是IL-10，由固有免疫細胞(如巨噬細胞、DC)和適應(yīng)性免疫細胞(如B細胞和CD4+ /CD8+T細胞)產(chǎn)生。IL-10能抑制參與病原體清除作用的細胞的活性，如巨噬細胞，Th1 細胞和NK細胞[15]。體內(nèi)和體外實驗均證明IL-10在PCV2感染過程中發(fā)揮的重要作用。PCV2可感染體外培養(yǎng)的外周血單個核細胞(PBMCs)，尤其是單核細胞/DC/巨噬細胞群體。IL-10的表達受到PCV2的誘導(dǎo)，PCV2感染PBMCs后釋放的IL-10可抑制IFN-γ,IFN-α和IL-12 的表達，這些受抑制的細胞因子是受到具有記憶功能的抗原刺激產(chǎn)生的[16]。實驗表明，IL-10在該細胞群中誘導(dǎo)的可能途徑通過toll樣受體9(TLR9)來控制，TLR9是一種識別非甲基化的內(nèi)源性表達受體DNA[17]。PMWS感染的豬體胸腺中IL-10的轉(zhuǎn)錄水平升高，這與胸腺耗竭和萎縮有關(guān)。在PMWS感染的豬群中，由PCV2誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-10是導(dǎo)致免疫紊亂的關(guān)鍵細胞因子，機體IL-10的分泌與PMWS相關(guān)，全身IL-10水平與感染后21d血液中的病毒量也有關(guān)系。總之，體外實驗可以通過識別固有細胞類型，對細胞因子分泌的早期進行研究；體內(nèi)實驗可以研究病毒感染對組織和適應(yīng)性免疫細胞的影響。實驗證實，IL-10是影響固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要細胞因子，也是出現(xiàn)PMWS的重要原因之一。

1.2 PCV2感染后的特異性免疫應(yīng)答

從胚胎到個人發(fā)育過程中，關(guān)于PCV2引起的體液免疫應(yīng)答機制研究得較成熟。一方面由于血清樣本較容易獲得，使用常規(guī)方法就能檢測出PCV2抗體；另一方面源于疫苗研制過程中對具有免疫原性的衣殼蛋白的深入研究。母畜妊娠期感染PCV2，在妊娠70d左右即可產(chǎn)生針對PCV2的體液免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生特異性抗體[18]。也有研究表明母畜妊娠前感染PCV2，在妊娠期可通過胎盤將病毒傳播給胎兒，并在胎兒體內(nèi)檢測出一定載量的病毒。這一發(fā)現(xiàn)對PCV2感染引起流產(chǎn)機制的研究具有重要意義，因為病毒可能僅僅來源于母體，目前還需要更多數(shù)據(jù)來證明這一發(fā)現(xiàn)。出生后，由于在初乳中存在母源抗體，仔豬可以免受PCV2侵襲。中和抗體可以有效地清除病毒并阻礙其復(fù)制。這些通過被動免疫獲得的抗體,滴度在哺乳過程中會逐漸下降，母源抗體的減少使動物再次易受PCV2感染。然而抗體滴度下降后便會導(dǎo)致PCV2復(fù)制的增加、嚴重的淋巴樣病變，甚至引發(fā)PMWS[19]。在感染過程中，抗體主要針對Cap蛋白產(chǎn)生，同時也針對非結(jié)構(gòu)Rep蛋白產(chǎn)生。在健康和PMWS感染的豬群中，抗Cap抗體產(chǎn)生較早，且其滴度高于抗非結(jié)構(gòu)Rep抗體。

然而，PCV2抗體對機體的保護作用是有限的，細胞免疫應(yīng)答的作用也不容忽視。IFN-γ分泌細胞(SC)的發(fā)現(xiàn)，已證實其與血清中PCV2病毒載量呈負相關(guān)。PCV2特定IFN-γ-SCs為T細胞，在抗原的刺激下能產(chǎn)生夠產(chǎn)生IFN-γ,其水平可用來評價細胞免疫功能。在PCV2感染或注射疫苗后IFN-γ產(chǎn)生的量有所增加。并且IFN-γ-SCs對非結(jié)構(gòu)Rep蛋白和結(jié)構(gòu)Cap蛋白的作用都是特異性的[20]。PCV2感染引起的PMWS病豬均出現(xiàn)B細胞和T細胞減少的現(xiàn)象(包括B淋巴細胞和CD3+CD4+、CD3+CD8+記憶/活化的Th淋巴細胞的減少)。另外，疫苗接種和感染都會誘發(fā)記憶/活化Th細胞的產(chǎn)生。抗原特異性記憶T細胞在病毒感染和疫苗接種后長期存在，再次接受抗原刺激后能夠快速擴增并產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答來對抗PCV2的感染。在疫苗接種或病毒感染后，產(chǎn)生的PCV2特異性CD4+T細胞，能夠產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，這些細胞因子在抵御和清除PCV2感染過程中發(fā)揮了重要作用。研究表明，所有接種疫苗或受PCV2感染的豬體內(nèi)均產(chǎn)生了這些細胞因子，但是特異性抗體的產(chǎn)生率僅僅不到45%[21]。這些結(jié)果進一步強調(diào)了細胞免疫在防御和清除感染動物PCV2中的重要性。

2 PCV2病毒的變異

PCV2是引起豬群疾病重要的豬病原體之一，嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，PCV2疫苗廣泛應(yīng)用于大型農(nóng)場，在一定程度上產(chǎn)生了免疫效應(yīng)，但無法完全抵御PCV2的感染，病毒仍然出現(xiàn)持續(xù)傳播的趨勢。在接種疫苗的豬群中，PCV2復(fù)制比(R0)約為1.5，而在未接種疫苗的豬中(R0)為5.2。因為R0測量的是個體感染病毒后感染水平的平均值，R0 > 1表示該病原體在種群內(nèi)持續(xù)存在。因此，PCV2疫苗在降低感染力方面非常有效，但不能清除環(huán)境中出現(xiàn)的病毒[22]。

通過系統(tǒng)進化分析，依據(jù)Cap基因?qū)CV2分為五種基因型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[23]。早在2000年，PCV2a是農(nóng)場中發(fā)現(xiàn)的最廣泛流行的基因型，隨即被PCV2b基因型取代并且引起了嚴重的PMWS暴發(fā)。PCV2c最初在丹麥發(fā)現(xiàn)，農(nóng)場的發(fā)生概率比較低。PCV2d已經(jīng)出現(xiàn)，有人認為其顯性基因型新的轉(zhuǎn)移可能會持續(xù)進行。據(jù)估計，PCV2b和PCV2d出現(xiàn)于大約20年前，與出現(xiàn)全球性PMWS爆發(fā)的時間吻合。基因型遺傳趨異分析反映了不同基因型在豬群中流行的時間，PCV2a遺傳趨異程度最高，其次是PCV2b和PCV2d。各個基因型間的全基因組差異約為8% ～ 12%，其中PCV2c差異最大，其次為PCV2d。幾種基因型的衣殼蛋白氨基酸序列差異在6% ～ 15%之間[24]。PCV2的變異性由其高變異率決定，自然選擇進一步加速了其變異速度。事實上，由于Cap基因的突變，新的抗原變異已經(jīng)出現(xiàn)。新一代測序技術(shù)已經(jīng)測定出低頻突變，低頻突變體不適合在既定環(huán)境中生存，但會形成儲存體，使病毒快速適應(yīng)不斷變化的外界環(huán)境。有時可能發(fā)生有益突變，并迅速增加它們在病毒種群中的分布。Rap基因具有較高的保守性，而Cap基因具有較大的變異性。研究表明，來自不同豬群的多克隆血清與來自單一基因型的隔離群相比，前者具有不同水平的中和抗體。另外，在Cap蛋白中發(fā)現(xiàn)了幾個線性表位(25-43、69-83、113-127、117-131、169-183和193-207殘基)和構(gòu)象表位(47-85、165-200和230-233殘基)[25]。這些區(qū)域包含了在陰性和陽性選擇下的位點，尤其是非保守位點處于陽性選擇狀態(tài)，被認為是宿主免疫系統(tǒng)的靶向位點。PCV2蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域是其功能的關(guān)鍵區(qū)域，這些區(qū)域中的位點發(fā)生的任何突變對病毒都是不利的。

目前的研究正在進一步了解疫苗接種對PCV2進化的長期影響。一些事實表明疫苗的接種可以促進PCV2的進化。在美國、德國和西班牙等重要的生豬生產(chǎn)國，疫苗接種得到了廣泛的應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計90%以上的動物都接種了疫苗。但是由于豬群的密度很高，任何傳染病都能迅速傳播。此外，由于疫苗不能完全預(yù)防PCV2的感染，盡管接種了疫苗，農(nóng)場中PCV2仍在繼續(xù)蔓延傳播。已有證據(jù)表明，在接種疫苗和未接種疫苗的農(nóng)場中發(fā)現(xiàn)的PCV2種群在其基因組組成上存在差異[26]。此外，接種疫苗的豬群中也發(fā)現(xiàn)了新的PCV2d分離株，并且這些感染的豬群患有PMWS。實驗證明，針對PCV2a的疫苗對PCV2d是有效的。目前，仍需要更多的工作來研究疫苗接種在病毒進化過程中的作用，特別是在接種疫苗的動物中出現(xiàn)疾病的病例。

3 小結(jié)

大多數(shù)豬體都有有效的免疫機制來清除或抑制PCV2的感染。未感染PCV2的健康豬群通過體液和細胞免疫應(yīng)答來清除并限制病毒。中和抗體的滴度與PCV2復(fù)制增加、嚴重淋巴樣病變和PCV2系統(tǒng)性疾病(PMWS)的發(fā)生有關(guān)。自然感染或接種疫苗后，抗原特異性細胞能長期存活，并能在抗原識別記憶性T細胞控制PCV2 感染中起重要作用。但是，仍有一定比例的豬群可能無法抵抗感染并發(fā)展成PMWS。如今，有效的疫苗接種可以在一定程度上控制疾病的發(fā)展。接種疫苗可以啟動免疫系統(tǒng)，當(dāng)遇到PCV2病毒時，可以迅速有效地激活免疫應(yīng)答。由于疫苗并不能完全預(yù)防PCV2感染，考慮到病毒的突變能力，在疫苗接種的情況下出現(xiàn)PCV2的進一步進化是非常有可能的。另外，疫苗的接種對PCV2的進化產(chǎn)生一定影響，并出現(xiàn)新的分離株。