對蝦肝胰腺微孢子蟲病與蝦肝腸胞蟲關系的研究進展

彭張明，陳妃業，蒲桂川

（1.海南海壹水產種苗有限公司，海南 海口 571126；2.湛江海壹水產種苗有限公司，廣東 湛江 524025）

微孢子蟲Microsporidia 是一種可感染多種真核生物的專性細胞內寄生蟲，目前被認為是真菌的姐妹群（sister group）[1]。自19 世紀第一次在家蠶中發現微孢子蟲Nosema bombycis 以來，到目前為止,其仍然是導致養蠶業巨大經濟損失的致命性微粒子病的主要病原[2，3]。在養殖泰國黑虎蝦（又稱斑節對蝦）Penaeus monodon 和凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei 中先后報道了兩種對蝦微孢子蟲感染病例，分別是對蝦八孢蟲Agmasoma penaei 和蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）。對蝦八孢蟲主要感染結締組織和肌肉，使肌肉纖維退化衰退，使對蝦通體呈乳白色，而EHP 主要寄生在對蝦的肝胰腺組織中[4-7]。近年來，其他八個種對蝦微孢子蟲也在對蝦養殖中被發現[8-15]。王元等[16]在國內首次報道了一種微孢子蟲感染脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda 的臨床癥狀，分析了該病原的形態結構、寄生部位以及造成的病理變化。隨著該疾病的流行與傳播，自2009 年以來亞洲主要對蝦養殖區域（如泰國、中國、印度、越南、印度尼西亞和馬來西亞等）均有報道，2017 年委內瑞拉也報道了該疾病，現已對全球對蝦養殖產業構成了威脅，使全世界的對蝦養殖業受到巨大損失[5,17-19]。

本文概述與分析了EHP 與HPM 的發生與流行、臨床體征與病理特征、致病機理、診斷方法及防控措施等，以期為進一步研究HPM 和其他蝦類疾病提供參考。

1 發生與流行

1.1 對蝦HPM 的發現與傳播

Pasharawipas 等[20]于1994 年首次報道印度Chennai（金奈）地區斑節對蝦的結締組織和肌肉感染了對蝦八孢蟲，隨后Lightner[21]也報道了美國佛羅里達州對蝦八孢蟲對肌肉組織的感染。2009 年和2013 年，Tourtip 等[6]和Tangprasittipap[5]分別報道了EHP 感染泰國地區的斑節對蝦和凡納濱對蝦的研究。隨后，同樣的微孢子蟲感染問題波及到了亞洲許多國家。在泰國研究發現，對蝦八孢蟲不能通過孢子或同類相食在養蝦池中水平傳播，因此可采取將孵化池、養殖池中的魚類等疑似宿主徹底清除的控制策略，大幅降低“棉花蝦”的流行率[22，23]。而EHP可以通過孢子和嗜食同類進行水平傳播[5,24]，即便是養殖池塘中對蝦糞便中釋放的孢子，也是可以讓對蝦感染EHP，因此要徹底清除孢子需要花費大量時間和昂貴代價，控制EHP 更加困難，所以，EHP是目前引起HPM 最重要的病原，EHP 的發生和流行已成為全球對蝦養殖業中高度重視和亟待解決的問題。

1.2 對蝦HPM 的流行與危害

病原傳播是水產養殖面臨的主要問題，例如在泰國，EHP 引起的HPM 已經成為繼白斑病（white spot disease，WSD）和急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）后影響泰國對蝦養殖的第三個最棘手的問題[25]。在亞洲和南美洲的一些國家，對蝦養殖為國民收入做出了重要貢獻，對蝦養殖業快速發展促進了亞洲當地經濟繁榮，每年的出口收入達數十億美元，然而在印度，2018 年對蝦微孢子蟲（EHP）在對蝦養殖中的流行，對蝦減產10%～20%[26,27]。中國自2013 年首次發現EHP 以來，主要的對蝦養殖區域先后都發現HPM的流行，中國漁業報[28]報道浙江省2015 年上半年凡納濱對蝦蝦苗EHP 攜帶率為23.1%。王博雅等[29]抽樣分析得到，2015 年遼寧省26 個凡納濱對蝦病樣中EHP 檢出率為34.6%。陳祿芝等[30]調查發現，2016 年粵西地區對蝦樣品的EHP 檢出率為41.38%，從2017 年湛江市的EHP 流行情況來看，隨機抽取的蝦樣品EHP 陽性率也達到了30%[31]。申紅旗等[32]調查發現：2017 年河北省南美白對蝦EHP 引起HPM 的發病率為3.58%，實際發病率應高于書面調查數據。2015—2017 年許杰等[33]在天津市采集養殖對蝦及餌料生物樣品中EHP 的陽性率依次為56.96%、69.52%和29.28%，可見2017 年天津市EHP流行率呈顯著下降趨勢。2015—2016 年，江蘇如東地區大面積養殖的對蝦出現嚴重滯長現象，致使該地區凡納濱對蝦減產15%～30%。抽樣檢測發現：滯長蝦EHP 的小亞基（small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因幾乎全部陽性[34]。

2 臨床體征與病理特征

2.1 感染EHP 的對蝦HPM 臨床體征

對蝦感染EHP 導致HPM 后一般不會引起對蝦死亡，可正常攝食，腸胃充滿食物，與正常對蝦幾乎沒有區別，但是，生長明顯緩慢，規格差異顯著，飼料系數升高[35]，嚴重時腸道發炎，肝胰腺萎縮、發軟，行動遲緩，個別蝦還有白便現象[36]。實驗結果顯示，感染EHP 的5 日齡凡納濱對蝦苗，肝胰腺開始變色；30 日齡后，蝦苗生長遲緩，個別發現白便現象。需說明的是，蝦苗的飼料顏色與肝胰腺的顏色變化有關，因此，在蝦苗未被證實感染EHP 之前，通過觀察蝦苗肝胰腺顏色變化來判斷蝦苗是否感染EHP 沒有意義[36]。EHP 感染還將導致對蝦變瘦，重量降低，這也直接影響對蝦養殖產量[37]。

2.2 感染EHP 的對蝦HPM 病理特征

對蝦HPM 的組織病理表明：在肝胰腺中可見早期孢原質（early sporogonal plasmodia）、后期孢殖團（late plasmodium）和成熟孢子（mature spores）等[6,36]。取對蝦肝胰腺進行熒光原位雜交試驗（fluorescent in situ hybridization，FISH），在電子顯微鏡下可觀察組織病理與EHP 不同的孢子發育階段[24]。凡納濱對蝦感染EHP 后，肝胰腺小管上皮細胞中存在明顯雜交信號[17]。施惠等[38]剖檢EHP 感染的凡納濱對蝦組織，發現鰓和肌肉未見明顯病理變化，而肝胰腺出現明顯病理體征，如可觀察到大量（1.3±0.2）μm×（0.8±0.2）μm 的EHP 孢子顆粒；肝胰腺腔體變小或消失，細胞腫大，肝胰腺上皮細胞腫大，細胞核壞死、消失；肝胰腺上皮細胞出現局灶性壞死或脫落，細胞中存在不同階段的EHP 孢子。趙若恒等[39]采用差速離心和密度梯度離心方法，從感染蝦肝腸胞蟲對蝦的肝胰腺中純化出了孢子，用透射電鏡、熒光桃紅染色觀察、血球計數板計數純化出的孢子。電鏡觀察表明：孢子為大小在0.7～1.2 μm 的橢圓形。蔗糖密度梯度離心等方法研究發現，江蘇如東地區對蝦EHP 孢子大小約為1.7 μm×0.9 μm，外壁上有大量白色瘤狀物，疑似胞壁蛋白，孢子表面布滿細小褶皺，孢子具有一個細胞核，極絲4～6 圈，細胞壁由一薄的電子透亮的孢子內壁和電子致密的孢子外壁組成[34]。這些研究直接說明了EHP 存在的巨大危害性，而對蝦八孢蟲、匹里蟲Pleistophora 和微粒子蟲Nosema 等在對蝦養殖中鮮有報道，間接表明這些種類不是導致對蝦HPM 主要的致病原。

3 致病機理

3.1 EHP 的傳播途徑及侵染機制

共生及飼喂實驗證明，EHP 可通過養殖水體傳播，以及攝食寄生EHP 的鮮活餌料、病蝦、死蝦而感染，即所謂的水平傳播[5,24]。丁慧昕等[40]初步證明：EHP 一旦在養殖水環境中存在，即可通過流水分布于養殖環境中，還可以在其他水生生物體內存活，健康蝦可以通過攝食寄生EHP 的病死蝦或養殖水環境中的孢子體而感染。而對EHP 垂直傳播，即通過親蝦傳播給子代，目前暫未見報道。EHP 是一種專性、細胞內的寄生蟲，其侵染細胞時需要一系列合適的條件。普遍認為，在感染第一步，EHP 孢子壁上的蛋白與宿主細胞的糖胺聚糖相互作用，然后在適合的條件下，極管通過擠壓穿透宿主細胞膜。該過程2 ms 內就能完成，最后極管作為導管將具感染性的孢子體轉移到宿主細胞中，進入寄生細胞內階段[41-43]。測定發現，感染EHP 的凡納濱對蝦血淋巴中總蛋白、白蛋白含量、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）和堿性磷酸酶活性等生化參數均顯著高于正常蝦[44]。

3.2 EHP 的增殖與致病

對蝦肝胰腺為EHP 提供了最適宜的寄生增殖條件，與其胞內寄生生活相適應。EHP 在進化過程中失去了合成ATP（糖酵解）的功能，而該功能是真核生物產生ATP 的基本通路之一，因此，EHP 只能直接從宿主細胞獲得能量，維持其生長繁殖、能量代謝，從而影響宿主的能量代謝[45]。劉珍等[46]用實時熒光定量PCR（qPCR）研究發現，當對蝦肝胰腺中EHP SSU rRNA 的相對拷貝數在103copies/（ng Hp DNA）數量級或EHP 載量指數在3 以上時，表現出EHP 較高的風險水平，且對蝦EHP 的載量指數與對蝦生長速率呈負相關，但在較低的差異范圍內，EHP 載量與對蝦生長的相關性不明顯。程東遠[47]用實時熒光定量PCR 檢測已感染EHP 對蝦不同組織中EHP 的含量，結果顯示：肝胰腺＞中腸＞血淋巴＞鰓＞肌肉。原位雜交得到：EHP 主要感染肝胰腺，其他組織中EHP 含量較低。徐勝威等[48]用熒光定量PCR 技術分析得到，氨氮在一定濃度范圍內可以有效控制EHP 的攜帶量。養殖水體氨氮濃度為6.0～9.0 mg/L 時，可以有效減少凡納濱對蝦EHP 的攜帶量，為凡納濱對蝦的養殖提供了一個重要的指導方向。從以上可知，EHP 導致對蝦HPM 的致病能力非常強，當蝦體中EHP 的含量超過一定數值后，對蝦的危害不言而喻。鑒于此，未來針對EHP 建立的細胞感染模型將會成為探究EHP 致病機理的重要方向，進而得到有效避免EHP 傳播和感染的方法和措施。

4 診斷方法

4.1 EHP 檢測方法的發展

對蝦感染EHP 引起的HPM 沒有明顯或特定的臨床癥狀，加之又恰逢2006 年亞洲地區AHPND 的大規模爆發，導致EHP 感染早期階段沒有引起足夠的重視，在全球的斑節對蝦和凡納濱對蝦養殖中廣泛傳播，對蝦生長緩慢的問題越來越普遍，經濟損失越來越嚴重，直接或間接地威脅著整個對蝦養殖業的發展[49,50]。隨著人們對EHP 的認識不斷深入，其診斷方法也迅速發展，出現了一大批EHP 的診斷技術與檢測方法，極大地促進了EHP 防控技術和生物安保理念的發展。EHP 的診斷方法主要包括兩大類，一類是無法進行定量情況下，只能定性描述病原微生物，例如組織病理和細胞病理學觀察、常規PCR 分析、套式PCR（nested PCR）、環介導等溫擴增（LAMP）和地高辛標記核酸探針原位雜交等[5,50-52]；另一類EHP 的定量檢測，主要是實時熒光定量PCR，包括SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 和TaqMan探針qPCR[53,54]。

4.2 病原的診斷方法

4.2.1 染色鏡檢法

EHP 的定性診斷方法中，組織病理和細胞病理觀察需要借助光學或電子顯微鏡。EHP 屬于胞內寄生，其大小約為0.75～1.0 μm，個體非常小，病理觀察時通常借助組織切片[50]。電鏡下，可在肝胰腺上皮細胞中發現從早期孢原質到成熟孢子的不同發育階段的EHP[24]。常曉晴等[55]用8 種染色方法觀察了感染EHP 的凡納濱對蝦肝胰腺的組織病理切片。結果顯示：Masson 染色法對組織細胞結構染色效果較好，檢出率也最高，非常適用于組織內EHP 孢子的染色觀察。

4.2.2 現代分子生物學檢測工具

目前所使用的分子工具，包括常規PCR、套式PCR、LAMP 及原位雜交對EHP 的診斷，都是通過核酸以SSU rRNA 基因的序列為目的基因來確定[50-52]，但是，與海洋生物中密切相關的微孢子蟲SSU rRNA 序列可能會對EHP 產生假陽性，例如寄生在魚和鹵蟲中的某些微孢子蟲，若以此魚和鹵蟲作為蝦飼料時，SSU-PCR 方法就有可能導致抽樣該飼料及親蝦糞便進行PCR 檢測時出現EHP 假陽性的結果，造成一些不必要損失[52]。基于此，推薦利用基于EHP 的孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列建立的一種更為特異的套式PCR 檢測方法，稱為SWP-PCR，其在PCR 第一步反應中比SSU-PCR 更敏感，總體上更具辨別力[52]。葉健等[56]采集不同樣本通過3 種PCR 方法檢測EHP，結果表明18S-PCR 在第一步擴增的靈敏度最好，SSU-PCR在第二步擴增的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但存在著一定的假陽性現象，建議檢測凡納濱對蝦苗種的蝦肝腸胞蟲時，宜采用靈敏度更高的套式。除此之外，基于EHP 的孢壁蛋白，運用免疫電鏡（Immunoelectron analysis，IEM）進行亞細胞定位，也可以準確定位EHP 的存在[57]。

4.3 EHP 的定量檢測方法

4.3.1 熒光定量PCR（qPCR）檢測方法

EHP 的定量檢測診斷中，SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 和TaqMan 探針qPCR 的引物設計也是基于EHP SSU rRNA，并以含有一定量的EHP SSU rRNA 靶片段的重組質粒DNA 為標準模板[46,53]。實際應用中，TaqMan 探針法具有更高的檢測特異性，但是，檢測費用高。SYBR GreenⅠ熒光法的檢測成本低且操作簡單，因此，更加廣泛地應用于快速檢測，但SYBR GreenⅠ熒光染料qPCR 缺乏特異性熒光探針，可能產生引物二聚體和非特異性擴增產物的干擾，影響結果的準確性，甚至產生假陽性結果[53]。TaqMan 探針qPCR 相比SYBR GreenⅠ擁有更高的敏感性和特異性，一次反應最低，檢測病原含量靈敏度可以達到4×101copies，在國際獸疫局（OIE）對水生動物對蝦病原體診斷標準中，該法經常作為12 種病原體定量檢測的標準方法[53,58]。

4.3.2 國內EHP 定量檢測方法建立

國內開展了眾多EHP 定量檢測研究，報道了所建立方法的穩定性、重復性、敏感性及應用情況[54,59,60]，張娜等[61]針對EHP 18S 相關保守序列設計了1 對特異性引物，優化并建立了EHP 的Taqman 熒光PCR 檢測方法，所建方法重復性較好，在模板濃度為6.5×102copies/μL DNA 時，仍有較強熒光信號，較普通PCR 方法檢測靈敏度至少高出1 個數量級；黃紀徽等[62]采用一種新型的等溫核酸擴增技術——重組酶介導擴增（recombinase-aid amplification，RAA）技術檢測EHP，基于EHPSSUrDNA 序列，建立快速檢測EHP 的RAA 恒溫熒光檢測方法，RAA 進行到24 個循環反應時可以檢測最小濃度10 copies/μL 的質粒，相當于10 個病毒粒子。

鑒于目前養殖對蝦的肝胰腺組織中未報道被EHP 以外的微孢子蟲感染，因此，針對對蝦肝胰腺組織的EHP 檢測，基于SSU rRNA 基因序列的相關SSU-PCR 檢測仍然是可信的方法，但是檢測糞便、餌料生物、飼料以及環境中潛在的EHP 時，推薦使用SWP-PCR[52]。

5 防控措施

5.1 切斷EHP 易感途徑

目前還沒有確定的藥物可以治療感染EHP 導致HPM 的對蝦，因此首要措施是預防。在對蝦養殖過程中要認真檢查重要的易感環節，首先是種源，對親蝦和苗種進行EHP 檢測；其次是投喂飼料，控制餌料投喂，監測養殖水體的EHP；最后是關注行業對蝦的疫情檢測等，通過以上措施來控制EHP 的傳播和感染。具體來說，推薦按照最佳管理措施（best management practices，BMPs）開展對蝦種苗繁育與養殖工作[63]。例如育苗前用pH1 左右的鹽酸溶液或pH＞11 的堿性溶液消毒所有育苗工具，晾曬干燥5d 以上，全力保證所培育的蝦苗為無特定病原（specific pathogen free，SPF）的苗種；高位養殖池塘用高濃度有效氯或高錳酸鉀溶液徹底消毒，一般的土池塘底要用生石灰充分消毒和晾曬；PCR 檢測蝦苗確保不攜帶有EHP 病原；盡量避免投喂鮮活餌料，可將鮮活餌料置于-20℃以下冰凍或者巴氏滅菌法處理后再投喂。

5.2 嚴格把好苗種質量關

對蝦苗種行業更需要重視蝦苗培育過程中的EHP 防控。在高密度工廠化育苗過程中，蝦苗感染EHP 的幾率和風險遠遠大于低密度的成蝦養殖。已發現的各種致病微生物感染蝦，早期蝦苗比養殖中晚期更易被感染，且被EHP 感染的蝦苗極具威脅性，養殖成功率下降。因此，選擇蝦苗的首要標準是未攜帶EHP 病原的蝦苗。對檢測確診感染了EHP的蝦苗，應在育苗場進行無公害化處理，嚴禁蝦苗流入市場。

6 總結與展望

在對蝦養殖過程中，隔離病原體是一種有效控制病原傳播的方法，但它需要對受感染的動物進行早期鑒定，快速診斷，用適當的抗生素或控制致病病原體以減輕損失[64]。而EHP 作為一種專性細胞內寄生蟲，是對蝦HPM 最重要的致病原，對蝦一旦感染了EHP 目前還沒有有效藥物能夠治療，從養殖的各個環節預防EHP 的感染和傳播是重中之重。鑒于此，對蝦育苗企業需要義不容辭地對蝦苗EHP 的生物安全擔當與負責，堅持企業初心，為行業提供優質蝦苗、良心蝦苗。為更準確、快捷診斷環境中EHP的存在，降低因SSU-PCR 檢測存在的假陽性，期待早日開發出基于EHP 孢壁蛋白（EhSWP1）基因序列的實時熒光定量PCR 的檢測方法，為預防EHP的傳播提供準確方向，期待借助EHP 侵染宿主的機制開發出預防及治療EHP 的方法。